食管癌是常见的消化道肿瘤, 其发病存在明显的地域差异, 以东亚多见, 我国是食管癌发病大国。由于大部分患者就诊时已经处于食管癌晚期, 已失去手术治疗机会, 预后极差, 其5年生存率仅为30%左右[1]。针对晚期食管癌患者, 临床上多采用联合放化疗, 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)作为食管癌化疗的常用药, 难免出现耐药, 因此增加其化疗敏感性, 延缓耐药发生, 对于食管癌患者的治疗至关重要。阿司匹林(aspirin, ASA)是目前广泛应用的解热镇痛药, 研究表明阿司匹林还有抗肿瘤作用, 阿司匹林的使用可减少胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌等发病率和死亡率[2]。
上皮细胞间充质细胞转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞表型改变、黏附能力减弱、极性丢失后导致细胞运动、侵袭能力增强[3]。EMT不仅促进肿瘤发生以及侵袭转移, 而且还能增强肿瘤细胞的抗凋亡能力[4], 从而诱导化疗耐药[5]。研究表明食管癌患者化疗后残余肿瘤细胞发生EMT与化疗耐药相关[6], 提示抑制EMT可能为提高食管癌化疗敏感性的潜在靶标, 而阿司匹林是否可通过作用于该通路, 从而抑制食管癌细胞增殖、诱导细胞凋亡, 尚待研究。
目前关于阿司匹林与5-FU联合协同抗食管癌的相关研究仍未见报道。本实验拟通过阿司匹林联合5-FU作用于体外培养的ECA109细胞, 观察阿司匹林是否可以增加5-FU化疗敏感性, 抑制肿瘤细胞增殖能力, 促进其凋亡, 在此基础上明确其作用机制, 从而为临床上应用阿司匹林作为5-FU治疗食管癌时的辅助用药提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料人食管癌细胞株ECA109购自中山大学细胞库; DMEM高糖培养液(11995500BT)、胎牛血清(10270)、0.25%胰蛋白酶(25200-056)购自美国Gibco公司; 阿司匹林(A2093)、氟尿嘧啶(F6627)购自Sigma-Aldrich公司; 抗体cleaved caspase-3(#9661)、Bcl-2(#3498)、E-cadherin(#3195)、N-cadherin(#13116)、β-catenin(#8480)购自CST signaling; GAPDH(10494), PCNA(10205)购自proteintech公司, 凋亡试剂盒(AD10), CCK-8(CK04)检测试剂盒购自日本东仁化学公司。
1.2 实验仪器CO2恒温培养箱(RSBiotech); 酶标仪(BMG CLARIOstarⓇ Plus); 流式细胞仪(BD LSRFortessa); 倒置荧光显微镜(olympus IX71);化学发光仪(Tanon 4600);电泳仪(北京六一)。
1.3 实验方法 1.3.1 细胞培养人食管癌细胞株ECA109培养于含有10%FBS、1%青霉素和链霉素加DMEM高糖培养液, 置于37 ℃, 5% CO2培养箱内, 每3~4天用0.25%胰蛋白酶消化, 1 :3进行传代, 取对数生长期细胞进行试验。
1.3.2 CCK-8法检测细胞增殖ECA109细胞胰酶消化, 制备单细胞悬液, 1×104细胞接种于96孔板中, 于培养箱中培养, 24 h候待细胞贴壁, 每孔加入含0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1阿司匹林, 0、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1的5-FU的培养基, 设置无细胞DMEM培养基为对照组; 作用24 h后, 每孔加入10% CCK-8 100 μL, 继续孵育2 h, 于酶标仪检测450 nm处吸光度, 并计算不同药物对细胞增殖影响。
1.3.3 细胞凋亡检测采用日本东仁凋亡检测试剂盒, 细胞分4组进行处理：空白对照组, 0.125 g·L-1阿司匹林组, 0.1 mg·L-1 5-FU组, 0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-1 5-FU组, 六孔板培养24 h后, 胰酶消化, PBS洗3次, 100 μL binding buffer重悬, 每管加入5 μL PI, 5 μL Annexin V冰上孵育15 min, 再加入400 μL binding buffer。1 h内进行流式检测。
1.3.4 Western blot检测核蛋白采用碧云天核蛋白提取试剂盒, 细胞分四组进行处理：空白对照组, 0.125 g·L-1的阿司匹林组, 0.1 mg·L-1的5-FU组, 0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-15-FU为联合组。总蛋白采用RIPA细胞裂解液, 100 :1加入PMSF, 12 000转4 ℃离心15 min, 取上清, 加入5X上样缓冲液, 将样品放入100 ℃煮沸5 min, 蛋白变性后放于-80 ℃保存备用。SDS-PAGE凝胶电泳, 浓缩胶恒压80 V, 40 min, 分离120 V, 80 min。转至PVDF膜, 200 mA恒流, 2 h。5%BSA封闭1~2 h, TBST洗2次, 一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗3次, 二抗孵育1.5 h, TBST洗3次, ECL发光。ImageJ软件分析灰度值。
1.4 统计学分析所有试验重复3次。图片绘制采用Graphpad软件。实验数据采用SPSS23.0统计软件进行分析, 数据采用x±s表示, 进行独立样本t检验。
2 结果 2.1 5-FU、阿司匹林单用或联用对食管癌ECA109细胞增殖的影响CCK-8检测结果, 如Fig 1所示, 采用不同浓度的阿司匹林(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1)分别干预ECA109细胞, 发现阿司匹林对ECA细胞的增殖有不同程度抑制作用, 并呈浓度依赖性, 但只有当阿司匹林浓度≥0.25 g·L-1, 与空白组比较差异具有显著性(P＜0.05)。采用不同浓度的5-FU(0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1)分别干预ECA109细胞, 当5-FU浓度≥0.02 mg·L-1, 与空白组比较差异具有显著性(P＜0.05)。将0.125 g·L-1和0.25 g·L-1浓度的阿司匹林分别与0.1 mg·L-1浓度的5-FU联合应用于ECA109细胞, 细胞增殖都能被更有效抑制。提示低浓度无毒性阿司匹林能加强5-FU对ECA109细胞增殖抑制作用。
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Fig 1 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on proliferation of ECA109 cells (x±s, n=3)
NC: Negative control, ASA: Aspirin. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC, #P < 0.5, ##P < 0.01 vs 5-FU, △△P < 0.01 vs 5-FU+ASA 1:NC; 2: ASA (0.125 g·L-1); 3: ASA (0.25 g·L-1); 4: 5-FU(0.1 mg·L-1); 5:5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.125 g·L-1); 6:5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.25 g·L-1) |
如Fig 2显示, 与对照组(8.3%±0.7%)相比, 单用阿司匹林组(8.9%±0.7%)对细胞的凋亡无影响(P=0.36), 5-FU组(13.5%±0.8%)使ECA199细胞的凋亡率升高(P=0.001)。5-FU与阿司匹林联合用药组(23.7%±4.8%)对ECA109细胞的凋亡效率明显高于5-FU组(P=0.024)。
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| Fig 2 The apoptotic rate of ECA109 cells treated by single aspirin, 5-FU or their combination(x±s, n=3) NC: Negative control, ASA: Aspirin. **P < 0.01 vs NC, #P < 0.5 vs 5-FU |
进一步采用Western blot检测凋亡蛋白的表达。如Fig 3所示, 与单用5-FU组比较(Bcl-2：0.83±0.14;cleaved caspase-3：0.61±0.11), 5-FU+阿司匹林组联用组(Bcl-2：0.34±0.13, P=0.013;cleaved caspase-3：0.91±0.14, P=0.043)处理ECA109细胞会诱导Bcl-2蛋白表达显著下调、cleaved caspase-3蛋白表达显著上调。与空白组相比, 单用低浓度阿司匹林对Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达无影响。提示低浓度无毒性阿司匹林加强5-FU诱导食管癌细胞凋亡。
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| Fig 3 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on protein expression of Bcl-2, cleaved caspases-3, N-cadherin, E-cadherin and β-catenin in ECA109 cells(x±s, n=3) NC: Negative control; ASA: Aspirin; ECA: E-cadherin; NCA: N-cadherin; cl-c3: Cleaved caspases-3. *P < 0.5, **P < 0.01 vs NC, #P < 0.5, ##P < 0.01 vs 5-FU |
在EMT期间, 上皮细胞逐渐失去鹅卵石样上皮的形态, 变成呈纺锤形间充质形态, 大多数由此产生的间充质细胞可以逆转恢复上皮细胞状态, 称为间质上皮转化[7]。如Fig 4所示, EMT形态学变化, 经过低浓度阿司匹林处理后ECA109细胞从纺锤型外观变成鹅卵石样形态, 提示阿司匹林促使肿瘤细胞发生间质上皮转化。如Fig 3所示, EMT分子水平表现上, 与对照组(N-cadherin：1.34±0.16;E-cadherin：0.47±0.1;β-catenin：0.70± 0.09)相比, 阿司匹林单用处理ECA109细胞后均会诱导细胞显著下调间质性蛋白N-cadherin(N-cadherin：0.84±0.10, P=0.01)、上调上皮标记蛋白E-Cadherin(E-cadherin, ：1.26±0.14;P=0.01)和下调β-catenin蛋白(β-catenin:0.39±0.02, P=0.004)。与5-FU单用组比(N-cadherin：1.29±0.14;E-cadherin：0.79±0.16;β-catenin：0.69±0.05), 5-FU和阿司匹林联用组也能下调N-cadherin(0.42±0.10, P=0.001)、上调E-cadherin(1.24±0.16, P=0.026)、下调β-catenin(0.33±0.08, P=0.003)蛋白表达。
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| 图 4 EMT in ECA109 cells promoted by aspirin |
目前临床上食管癌治疗中, 5-FU是一线化疗药物之一, 因化疗耐药单药化疗有效率仅为10%~25%, 联合化疗虽然能提高化疗效率却增加化疗毒副作用[8]。同时5-FU的毒副作用呈剂量依赖性, 对骨髓和消化道毒性较大, 能否将本身无毒副作用且增加化疗有效性的药物与5-FU联用, 既可减少5-FU的使用剂量, 又可提高5-FU药效是近年关注的焦点。阿司匹林能增强抗肿瘤作用, 但阿司匹林有增加出血的风险。研究指出服用常规剂量(≥75 mg·d-1)阿司匹林能增加94%严重消化道出血发生率, 53%颅内出血风险和47%脑出血风险[9]。我们希望服用低剂量阿司匹林不影响其抗肿瘤效果, 且不增加消化道出血风险, 但关于最低有效剂量的定义目前尚无统一标准。欧洲(阿司匹林50~325 mg·d-1)[10]和中国(阿司匹林80 mg·d-1)[11]的前瞻性研究均发现长期低剂量服用阿司匹林可降低癌症发病风险, 包括肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、白血病等。有文献报道阿司匹林联合5-FU应用于HT-29结肠癌细胞, 通过诱发凋亡取得较好抗肿瘤作用[12]。目前尚无阿司匹林联合5-FU协同抗食管癌的研究, 本研究主要探讨无明显细胞毒性剂量阿司匹林增强5-FU对食管癌增殖抑制、诱导凋亡作用。
诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的有效策略, 当细胞凋亡受到抑制时, 可引起肿瘤细胞耐药[5]。5-FU耐药的重要原因之一, 便是凋亡抑制[13]。阿司匹林抗肿瘤作用也可通过抑制肿瘤细胞活性、破坏肿瘤微环境、抑制肿瘤细胞炎症、调节肿瘤细胞免疫、阻止肿瘤侵袭和转移、破坏对肿瘤细胞死亡的抵抗力并诱导细胞死亡等[14]。本研究证实, 虽然单药无毒性剂量阿司匹林对ECA109细胞凋亡、增殖无影响, 但与5-FU联用时, 可明显增加ECA109细胞凋亡率, 提示低剂量阿司匹林协同5-FU诱发更多食管癌细胞发生细胞凋亡。细胞凋亡是受多种基因精确调控的主动的、程序化的死亡过程。作为凋亡蛋白, Bcl-2是抑制凋亡基因, 下调可诱导肿瘤细胞凋亡, 发挥协同促凋亡效应; cleaved caspase-3是caspase级联反应下游效应分子, 是细胞凋亡过程中最关键的执行者。Western blot检测证明5-FU抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的表达和促进cleaved caspase-3蛋白表达, 进而诱导ECA109细胞发生凋亡, 且阿司匹林能增强5-FU促凋亡效果。与既往研究不同的是, 文献指出高浓度阿司匹林可下调Bcl-2蛋白和上调caspases-3蛋白进而诱发胆管癌细胞[15]凋亡, 由于本研究采用无毒性低浓度, 单用阿司匹林对Bcl-2和caspase-3蛋白表达和凋亡均无影响。
EMT的发生不仅促进肿瘤细胞的侵袭和转移, 也与肿瘤耐药密切相关。肿瘤细胞在产生耐药的过程中常伴随着间质化的改变, 而具有间质化的改变的肿瘤细胞也常变现为耐药的特点。发生EMT的肿瘤细胞常可获得凋亡抑制而抑制EMT可促进肿瘤细胞凋亡[4]。EMT的发生常伴随细胞形态的改变(获得纺锤状/成纤维细胞形态)、上皮细胞标志蛋白丢失(E-cadherin)、间充质细胞标志蛋白上调(N-cadherin、vimentin等)、细胞外基质的改变等。β-catenin/E-cadherin黏附复合体对维持上皮完整起着其中重要作用, 当发生EMT时, β-catenin从黏附复合体中大量释放至细胞质而入核, 同时伴随E-cadherin表达下调, N-cadherin表达上调。本研究表明阿司匹林可通过减少核内β-catenin含量, 诱使N-cadherin下调、E-cadherin上调, 进而抑制ECA109细胞的EMT进程, 提示抑制β-catenin/EMT信号通路是阿司匹林协同5-FU抑制ECA109细胞增殖、促进ECA109细胞凋亡重要机制。
综上所述, 在低浓度无毒性阿司匹林作用下, 5-FU抑制ECA109细胞增殖、诱导ECA109细胞凋亡的作用增强, 其机制可能与抑制β-catenin/EMT信号通路有关。本研究为阿司匹林联合5-FU应用于食管癌治疗, 提高5-FU化疗敏感性提供了参考依据。下一步我们拟构建荷瘤小鼠模型, 体内实验验证阿司匹林联合5-FU对食管癌的影响。
( 致谢: 本实验在南方医科大学中心实验室完成, 在此感谢所有对本实验支持和帮助的人。)
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