2. 天津市武警后勤学院，天津 300309;
3. 武警后勤学院病原生物学教研室，天津 300309;
4. 天津武警特色医学中心干部病房，天津 300162
2. Graduate School, Logistics University of the Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300309, China;
3. Dept of Pathogen Biology, Logistics University of the Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300309, China;
4. Cadre Ward of Tianjin Armed Police Characteristic Medical Center, Tianjin 300162, China
血管内皮下低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的积聚及其氧化修饰是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块形成的重要初始事件，而氧化修饰后的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作为心血管疾病的独立危险因素又能通过多种机制加速AS的进程，如诱导内皮细胞功能障碍、刺激泡沫细胞形成及促进平滑肌细胞迁移、增殖等[1]，新近研究显示，ox-LDL还可以刺激中性粒细胞释放大量胞外核酸网(neutrophil extracellular traps，NETs)[2]，近年发现一种与AS有着紧密联系的胞外核酸结构，其间结合有髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、组蛋白、弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)等具有抗菌作用的活性蛋白，除发挥固有免疫防御功能外，还可通过促炎、细胞毒性及促血栓等效应参与多种疾病的进程[3]，这或许是ox-LDL影响AS的新机制，而中性粒细胞受到刺激释放NETs的这一行为被称为NETosis。
曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)能够抑制脂肪酸β氧化、刺激葡萄糖氧化、增加三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的生成效率，临床上主要用于改善心肌代谢。近年研究发现，TMZ还具有调节细胞自噬[4]、抑制氧化应激、改善血管炎症等作用[5]，而自噬被证实与NETs有着非常紧密的联系[6]，提示TMZ或能通过影响细胞自噬有效干预NETs的形成。我们前期研究发现，使用TMZ干预能有效降低AS模型小鼠NETs水平，延缓斑块进展[7]，但对其具体作用机制尚需进一步研究阐明。本研究正是以此为出发点，首先通过体外细胞实验观察ox-LDL对NETs的诱导作用，而后进一步探讨TMZ对ox-LDL诱导NETs生成的影响及其与细胞自噬的关系，为防治AS提供新思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料8周龄健康C57BL/6♂小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0002；胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、D-PBS均购自Gibco公司；小鼠中性粒细胞分离试剂盒(货号p8550)购自索莱宝公司，Picogreen dsDNA定量试剂盒(P11496)购自Invitrogen公司；小鼠抗Ly6G-PE(12-5931-81)、CD11b-PE/Cy7(25-0112-81)抗体购自eBioscience公司；兔抗小鼠anti-MPO(ab208670)、anti-LC3b(ab192890)、anti-Beclin-1(ab207612)抗体及山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fuor® R488)抗体(ab208670)均购自abcam公司；佛波酯(PMA)(货号17673-25.5)购自TargetMol公司；ox-LDL(货号YB-002)购自广州奕源；曲美他嗪(货号HY-130968)购自MCE公司；Rapamycin(货号A10782-5)、Ly294002(A10547)购自Adooq Bioscience公司。
1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓中性粒细胞分离脊椎脱臼法处死小鼠，分离股骨与胫骨，剪去骨两端，PBS冲洗制备骨髓单细胞悬液，按照中性粒细胞分离试剂盒说明书，以密度梯度离心法分离提取中性粒细胞，用体积分数0.5%胎牛血清的无酚红DMEM高糖培养基(以下简称培养基)重悬细胞用于后续实验。分别取Anti-CD 11b、Anti-Ly6G抗体，根据试剂说明书操作双重标记细胞，流式细胞仪(CytomicsFC500，Beckman Coulter，USA)上机检测中性粒细胞含量，台盼蓝染色评估细胞活力。
1.2.2 流式细胞术检测ox-LDL对细胞活力的影响为探讨ox-LDL能否在干预浓度及时间内诱导中性粒细胞凋亡、影响细胞活力，将细胞按4×105个/孔接种于24孔板，培养箱内静置30 min，分别用50、100、200 mg·L-1 ox-LDL干预4h后收集细胞，200 μL Binding buffer重悬，加入5 μL AnnexinV-FITC避光孵育10 min，收集细胞再次加入200 μL Binding buffer重悬，加入5 μL PI直接上机，流式细胞仪收集6 000个事件进行分析。
1.2.3 实验分组及干预中性粒细胞按4×105个/孔接种于24孔板，每孔500 μL，静置30 min细胞贴壁后，分别用25、50、100、200 mg·L-1的ox-LDL干预4 h，设置阳性(PMA 100 nmol·L-1)及阴性(培养基)对照组，另外设置不同的干预时间(ox-LDL 100 mg·L-1干预0、2、4、6 h)进行对比。成功建立NETs诱导模型后，根据干预药物的不同将细胞分为对照组(培养基恒温孵育4 h)、ox-LDL诱导组(100 mg·L-1 ox-LDL刺激4 h)、TMZ+ox-LDL组(10 μmol·L-1 TMZ预处理细胞30 min后，100 mg·L-1 ox-LDL干预4 h，组内另设1、100 μmol·L-1 TMZ浓度组)、Ly294002+ox-LDL组(20 μmol·L-1 Ly294002预处理细胞30 min后，100 mg·L-1 ox-LDL干预4 h)组、Rapamycin+ox-LDL组(100 nmol·L-1 Rapamycin预处理细胞30 min后，100 mg·L-1 ox-LDL干预4 h)，各组在37 ℃ CO2体积分数为5%的恒湿培养箱中孵育相应时间后进行下列观察检测。
1.2.4 PicoGreen® dsDNA定量试剂盒检测上清cfDNA/nets水平各组干预完后抽取培养液，1 200 r·min-1离心10 min后取上清及配好的标准品100 μL加入到96孔板, 混以稀释浓度为5 mL·L-1的Picogreen 100 μL，室温避光孵育5 min后荧光酶标仪(LS55, Perkin Elmer, USA)检测荧光值(Ex 480 nm，Em 520 nm，Cut off 515 nm)，标准品浓度依次为1 000、100、10、1、0 μg·L-1，利用标准品绘制标准曲线并计算各组cfDNA/nets浓度。
1.2.5 免疫荧光观察NETs的形成上述各组细胞干预完后，4%多聚甲醛固定30 min；PBS浸洗后0.5% Triton X-100溶液室温通透20 min；再次浸洗后滴入山羊血清室温封闭30 min；吸去封闭液，一抗(anti-MPO抗体1 :200稀释)4 ℃孵育过夜；PBS清洗后，加入1 :1 000稀释的二抗山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fuor® R488)，室温孵育1 h；PBS清洗后，DAPI染液避光染色5 min；再次清洗，滴加甘油明胶后，荧光显微镜下观察。
1.2.6 Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3b以及髓过氧化物酶(MPO)的表达情况小鼠骨髓中性粒细胞按照2×106个/孔接种于6孔板，按上述方案干预后收集细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，混以1×Loading buffer 100 ℃加热变性7 min；SDS-PAGE分离等量蛋白后转膜；质量分数为5%的脱脂奶粉封闭1 h；一抗(anti-MPO、anti-LC3b、anti-Beclin-1均1 :2 000稀释) 4 ℃孵育过夜；洗膜3次，添加二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP-S0001 1 :5 000稀释)室温下孵育1 h；再次洗膜后ECL发光液显影。凝胶成像仪观察各蛋白表达情况, 结果采用ImageJ软件量化分析。
1.2.7 统计学分析所有数据以以x±s表示，SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 小鼠骨髓中性粒细胞分离纯度及活性流式细胞检测结果显示，与采用上述方法获得的小鼠中性粒细胞的纯度约95%(Fig 1A)，DAPI荧光染料标记后镜下可见细胞核呈分叶状(Fig 1B)，台盼蓝染色结果显示活细胞占比95%以上。
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| Fig 1 Isolation purity of neutrophils from mouse bone marrow A:Purity of mouse bone marrow neutrophils determined by flow cytometry; B:Fluorescent image of mouse bone marrow neutrophils after stained with DAPI |
流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，分别使用50、100、200 mg·L-1 ox-LDL干预中性粒细胞4 h后，各组细胞活力(cell viability)并未明显降低(P>0.05)(Fig 2)，提示采用上述浓度ox-LDL干预小鼠骨髓中性粒细胞4 h对细胞活力没有明显影响。
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| Fig 2 Effect of ox-LDL on cell viability of mouse bone marrow neutrophils(x±s, n=3) |
免疫荧光结果显示，ox-LDL以浓度-时间依赖的方式诱导中性粒细胞释放胞外网状核酸结构(Fig 3A)，与对照组(阴性)以及PMA组(阳性)对比结果证实，其主要成分为MPO-DNA复合物(Fig 3B)；PicoGreen® dsDNA试剂盒定量检测显示细胞上清液中cfDNA/nets含量与ox-LDL干预的浓度及时间呈正相关(Fig 3C)。参照Awasthi等[2]的研究，结合我们前期实验结果，我们选用ox-LDL 100 mg·L-1刺激中性粒细胞4 h作为后续诱导NETs的干预方式，在此条件下，镜下观察约60%中性粒细胞出现了NETosis，细胞周围出现大量特征性网絮状结构，细胞上清cfDNA/nets的含量较对照组明显增高。
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| Fig 3 Formation of NETs from mouse bone marrow neutrophils induced by Ox-LDL A: Representative fluorescence images of neutrophils stimulated by ox-LDL in different concentrations and for different time points (scale bar=100 μm). B: Unsimulated neutrophils and those stimulated with ox-LDL (100 mg·L-1) or PMA (100 nmol·L-1)for 4 h were fixed and analysed after labelling with antibody against MPO and DAPI, (scale bar=25 μm). C: Content of cfDNA/nets in supernatant after neutrophils stimulated by ox-LDL in different concentrations and for different time points determined by Quant-iT® PicoGreen® dsDNA Assay Kit (x±s, n=3).**P < 0.01 vs control. |
PicoGreen定量检测结果显示，各干预组细胞培养上清中cfDNA/nets含量均较对照组显著增高(P < 0.01)，但各组间存在明显差异；与ox-LDL诱导组相比，TMZ预孵30min后再以ox-LDL干预，上清cfDNA/nets的浓度明显降低(P < 0.01)，镜下观察网絮状结构出现，及NETosis的细胞数量减少，其程度与TMZ的干预浓度呈负相关；而Rapamycin +ox-LDL组细胞培养上清中cfDNA/nets含量较诱导组明显升高(P < 0.01)，镜下可观察到大量NETs特征性网状结构，且出现NETosis的细胞数量较诱导组明显增多，LY294002+ox-LDL组结果与之相反。见Fig 4。
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| Fig 4 Effects of different interventions on NETs release in neutrophils induced by ox-LDL A: TMZ 1.0 μmol·L-1+ox-LDL 100 mg·L-1; B: TMZ 10 μmol·L-1+ox-LDL 100 mg·L-1; C: TMZ 100 μmol·L-1+ox-LDL 100 mg·L-1; D: LY294002 20 μmol·L-1+ox-LDL 100 mg·L-1; E: Rapamycin 100 nmol·L-1+ox-LDL 100 mg·L-1; F: Ox-LDL 100 mg·L-1; G: PMA 100 nmol·L-1; H: Control: (scale bar=50 μm). I: Content of cfDNA/nets in the supernatant of each group determined by Quant-iT® PicoGreen® dsDNA Assay Kit (x±s, n=3). **P < 0.01 vs control, ##P < 0.01 vs ox-LDL 100 mg·L-1 induced group. |
Western blot结果显示，中性粒细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3b Ⅱ及MPO表达水平随ox-LDL诱导浓度增加而升高(Fig 5A)，经TMZ预处理后胞内自噬相关蛋白LC3b Ⅱ、Beclin-1及MPO蛋白水平较ox-LDL诱导组明显降低(P < 0.01)，并与TMZ预处理的浓度呈负相关(Fig 5B)；使用Ly294002预处理组细胞能够模拟上述实验结果；而Rapamycin+ox-LDL组细胞上述蛋白表达水平较ox-LDL诱导组进一步增高(P < 0.01)(Fig 5C)。
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| Fig 5 Expression of autophagy markers LC3b, Beclin-1 and protein of MPO in neutrophils (x±s, n=3) A: Neutrophils were treated with ox-LDL in different concentrations for 4 h; B : Neutrophils were pretreated with TMZ in different concentrations for 30 min and then treated with ox-LDL 100 mg·L-1 for 4 h; C: Neutrophils were pretreated with TMZ, LY294002, Rapamycin for 30 min and then treated with 100 mg·L-1 ox-LDL for 4 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control, ##P < 0.01 vs ox-LDL 100 mg·L-1 induced group. |
现已证实，NETs能够参与心血管疾病、血栓性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及多种炎症相关性疾病的发生发展，包括各类微生物及其成分、促炎因子、佛波醇(PMA)、一氧化氮、活化的血小板、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、钙离子和免疫复合物在内的多种物质或因子均可诱导NETs的产生，其中NETs与动脉粥样硬化性疾病的关联源于研究者们在AS患者及动物模型受损的管腔中检出高水平NETs标志物MPO-DNA复合物, 并证实血液中NETs含量和AS程度相关[8-9]，考虑到AS发病机制复杂且影响因素众多，因此诱导NETs产生的因素以及机制必然是复杂的，迄今尚未完全阐明。Awasthi等[2]在体外用人外周血中提取的ox-LDL成功诱导中性粒细胞释放大量NETs的研究，无疑是对这一问题的重要探索与补充，也为我们建立更加贴近机体内环境的NETs诱导模型提供了依据。据此，本研究以小鼠骨髓中性粒细胞为研究对象，利用ox-LDL体外刺激诱导NETs产生，通过免疫荧光及PicoGreen染色法定性、定量评价NETs的形成情况，成功建立了NETs的诱导模型。
自噬是真核细胞中必要的一种自我消化降解过程，通过调节细胞中蛋白质和细胞器的更替，在细胞生长代谢、结构重塑等过程中发挥着重要作用，而近年来研究证实，自噬与NETs的形成密切相关。NETosis的特征是中性粒细胞内染色质的解聚以及核膜的裂解，解聚后的染色质与胞质中的阳离子以及多种抗菌蛋白混合并逐渐形成液泡被释放到胞外，而Remijsen等[6]发现，自噬在PMA诱导NETs释放的液泡化过程中发挥了重要作用。另有研究表明，激活自噬能够促进NETs释放，而下调细胞自噬水平能够抑制NETs产生[8, 12]。ox-LDL或许是自噬的有效诱导剂，近期研究表明，ox-LDL可诱导血管内皮细胞、巨噬细胞发生自噬进而影响其生物学功能[10-11]。综上，自噬或许同样参与了ox-LDL对NETs的诱导过程。本研究结果显示，ox-LDL刺激4 h后，中性粒细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3bII表达水平较对照组明显增高，呈ox-LDL浓度依赖性，并与细胞中MPO的蛋白表达及上清cfDNA/nets含量的变化趋势一致；使用AKT/mTOR抑制剂Rapamycin预处理细胞，能够进一步上调Beclin-1、LC3bII的蛋白表达，并使上清cfDNA/nets的含量增高，而采用PI3K/AKT阻断剂LY294002预处理细胞则效果相反，表明自噬在ox-LDL诱导中性粒细胞释放NETs的过程中发挥了积极的促进作用。
近年研究显示，曲美他嗪(TMZ)可以通过调控自噬发挥作用，不过对于其调控方向尚无定论，有研究认为，TMZ能够上调细胞的自噬水平缓解氧化应激引起的损伤、抑制细胞凋亡而延缓疾病的进展[4, 13]。而Wu等[14]的研究结果显示，TMZ能够通过激活AKT/mTOR通路抑制细胞过度自噬，降低心肌缺血再灌注损伤。在本研究中，我们分别采用TMZ、LY294002、Rapamycin干预NETs的诱导过程，发现使用TMZ预处理能够下调小鼠骨髓中性粒细胞的自噬相关蛋白Beclin-1、LC3bII以及NETs的重要成分MPO的表达，显著降低上清cfDNA/nets水平。该作用能够被PI3K/AKT阻断剂LY294002所模拟，而使用AKT/mTOR抑制剂Rapamycin预处理则效果相反，提示TMZ能够通过下调中性粒细胞的自噬水平，抑制ox-LDL对NETs的诱导作用，降低NETs的产生。但是我们课题组前期的另一项研究发现[15]，采用ox-LDL与RAW264.7巨噬细胞共孵育24 h，诱导其成为泡沫细胞后，再以TMZ干预24 h，能刺激细胞发生自噬并释放胞外核酸网(METs)，一种类似NETs的网状结构。不过由于两组实验所使用的细胞不同，ox-LDL及TMZ的干预浓度、时间、方式差异较大，对于两组实验结果差异产生的具体机制需进一步研究阐明，另外，由于目前缺乏有关METs的深入研究，因此其与NETs生物活性的异同之处尚不明确。不过两组实验的差异提示，TMZ对细胞自噬的影响是复杂多重的，不同的干预方式、干预时间对细胞的自噬水平及NETs形成的影响可能不同甚至相反，这些都有待我们进一步研究探讨。
综上所述，ox-LDL能够以浓度-时间依赖的方式诱导小鼠骨髓中性粒细胞释放NETs，而TMZ能够通过下调中性粒细胞的自噬水平抑制ox-LDL对NETs的诱导作用，降低NETs水平。本研究充实了我们前期的研究成果[7]，从细胞水平证实了TMZ对NETs的调控作用，为扩大TMZ的临床应用范围提供了一定的理论支持。此外，本研究所阐述的TMZ、ox-LDL与自噬、NETs之间的相互作用及关系或能为预防AS提供了一种新的诊治策略，比如适当的使用自噬阻断剂，抑制自噬依赖的NETs释放或许是延缓AS进程新的治疗方式。需要指出的是，由于NETs与自噬生物学活性复杂、影响因素多，对于TMZ下调细胞自噬水平，以及抑制NETs释放的具体机制仍有待进一步研究，确切的分子机制还需要充分阐明，而且评价TMZ对NETs产生的影响以及对AS的治疗作用还需要更深入的基础及临床研究。
( 致谢: 本实验在天津市心血管重塑与靶器官损伤重点实验室完成，感谢课题组成员以及实验室王秀娟、陶燕燕老师和李远彬同学的支持与帮助！)
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