2. 朝阳市第二医院药剂科，辽宁 朝阳 122000
2. Dept of Pharmacy, the Second Hospital, Chaoyang City, Chaoyang Liaoning 122000, China
糖尿病心肌病是糖尿病患者主要的心脏并发症，心肌间质纤维化为其主要病理改变，也是引起糖尿病心室重塑导致心力衰竭的关键原因；其表现为心肌间质细胞增殖及表型转分化，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积等。Wnt/β-catenin信号通路是参与细胞生长、增殖的重要途径，与肺、肝脏及肾脏等多脏器纤维增生性疾病的发生密切相关[1-3]；Wnt/β-catenin通路的激活也参与了糖尿病心脏重构的病理过程[4]。目前，针对Wnt/β-catenin通路抑制剂的研究已成为防治纤维化相关疾病药物研究的重要靶点。丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是用于心血管系统疾病的传统中药丹参的主要活性成分，基础研究发现[5, 6]其对多种心血管损伤具有一定保护作用，如心肌缺血/再灌注损伤、2型糖尿病小鼠心肌病变等。但有关Sal B对糖尿病心肌纤维化的具体作用目前尚不明确，本研究通过体外培养心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)，高糖诱导模拟糖尿病高糖状态，基于Wnt/β-catenin信号通路，观察Sal B对高糖诱导CFs增殖及转分化的影响，探讨Sal B对糖尿病心肌间质纤维化的作用及可能机制，为传统中药防治糖尿病心肌病变提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物、药品与试剂1~3 d龄新生SD大鼠乳鼠(锦州医科大学实验动物中心提供)，动物使用许可证号：SCXK(辽)2016-0004。Sal B(美仑MB6598)；Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939(APEX BIO A1877)。DMEM培养基(Mediatech公司)；增强型CCK-8试剂盒(上海尚宝生物科技有限公司)；α-SMA抗体(博士德公司WL02509)；β-catenin抗体(abcam公司ab32572)；p-GSK 3β抗体(abcam公司ARG51777)。
1.1.2 仪器CO2孵箱(三洋公司)；相差显微镜(Olympus公司)；Mini-REPOTEANⅡ型电泳槽、电泳仪、Semi-dry Transfer cell(Bio-Red公司)；TGL-16G高速冷冻离心机(日立公司)；Biocell 2010酶标仪(Anthos Labtec Instruments公司)；数显气浴恒温震荡器(江苏CHA-SA)；化学发光凝胶系统分析仪(美国UVP公司)；Leica 4000B正置荧光显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法 1.2.1 CFs分离与培养新生SD大鼠乳鼠，♀ ♂不拘，体积分数75%的乙醇消毒，取出心脏，冷PBS冲洗2次，放于冷培养基中，剪约1 mm3组织碎块，加入0.25%胰酶37 ℃水浴中进行消化。将消化的上清加至含10%胎牛血清的培养基中终止消化。将收集的细胞1 000×g离心10 min，弃去上清。向沉淀中加入含10%胎牛血清的培养基，吹打均匀，制成细胞悬液。剩余组织继续按上述操作消化至组织消化完全，之后将细胞悬液均匀接种于培养瓶中，放入37 ℃、5% CO2孵箱。差速贴壁90 min后，弃去培养液，PBS冲洗细胞3次，更换新的培养基。细胞生长近融合状态时0.25%胰酶消化传代，本实验使用2~3代细胞。
1.2.2 CCK-8检测细胞增殖将对数生长期的CFs胰酶消化后，用培养液制成单个细胞悬液计数，以每孔300个细胞接种至96孔板，每孔100 μL，贴壁培养24 h，吸去上清，加无血清培养基，血清饥饿24 h。分别进行：①不同浓度葡萄糖对CFs增殖的作用：分为正常对照组(Control，含5.5 mmol·L-1葡萄糖)和葡萄糖组(含10、20、25、30、50 mmol·L-1葡萄糖)；②高糖诱导CFs增殖的时间效应：分为Control组，高糖组(HG组，含25 mmol·L-1葡萄糖)，作用时间分为12 h、24 h、48 h；③Sal B对高糖诱导CFs增殖的作用：分为Control组、HG组(25 mmol·L-1)、HG+ Sal B(12.5、25、50 μmol·L-1)、高渗透压对照组(MG组，含5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)。按上述不同的处理因素作用48 h，每组设6复孔。每孔加入CCK-8试剂10 μL，轻轻摇晃96孔板后放入37 ℃ 5% CO2培养箱中继续培养1 h，取出96孔板置于酶标仪上，490 nm测定各孔吸光度OD值。
1.2.3 分组及药物处理实验分为：① Control组(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，②MG组(含5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)，③ HG组(含25 mmol·L-1葡萄糖)，④ HG + Sal B组(25 μmol·L-1 Sal B预处理细胞1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑤ HG+XAV939组(1 μmol·L-1 XAV939预处理细胞1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑥ XAV939组(1 μmol·L-1)，⑦ Sal B组(25 μmol·L-1)。
1.2.4 苦味酸天狼猩红染色取出药物作用后的24孔培养板，弃掉培养基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定15 min。PBS清洗3次，0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)破膜20 min，PBS清洗3次，天狼猩红染液染色1 h，苏木素染液复染细胞核5 min，倒置显微镜下观察并拍照。
1.2.5 免疫荧光法各组CFs加不同条件培养基药物处理24 h后，吸去培养液，冷PBS漂洗3次；新鲜配制4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次；0.3% Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次；室温山羊血清工作液封闭60 min；滴加α-SMA一抗溶液，4 ℃孵育过夜；PBS漂洗，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗室温孵育1 h，PBS漂洗，用含DAPI的抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察及拍照。
1.2.6 Western blot各组CFs加不同条件培养基药物处理24 h后，冷PBS冲洗3次，立即放入预冷的裂解液中，每隔5 min震荡20 s，4 ℃ 12 000×g离心，取上清，BCA法进行蛋白质定量。每个泳道蛋白上样量为20 μg，行SDS-PAGE凝胶电泳，观察Marker移动情况。电泳后将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h，分别加兔抗大鼠α-SMA一抗、兔抗大鼠β-catenin一抗、兔抗大鼠p-GSK 3β一抗、兔抗大鼠GSK 3β一抗，4 ℃孵育过夜。次日早上取出膜，TBST洗膜3次，每次10 min，将膜放入山羊抗兔二抗(1 :1 000)中，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，行ECL化学发光显影。利用Visionworks 6.3.3图像采集及分析软件对蛋白带进行分析。实验重复3次。
1.2.7 统计学方法实验数据用表示，SPSS 18.0软件进行统计学分析。采用One-way ANOVA和LSD-t检验进行两两比较。
2 结果 2.1 不同浓度葡萄糖对CFs增殖的作用CCK-8结果(Tab 1)显示，不同浓度(5.5、10、20、25、30、50 mmol·L-1)葡萄糖诱导CFs 24 h，25、30、50 mmol·L-1葡萄糖诱导，CFs增殖率明显增加，实验中25 mmol·L-1高糖诱导时细胞增殖率已经达到196 %(P < 0.01)，本实验确定高糖诱导浓度为25 mmol·L-1。
| Group | Concentration /mmol·L-1 |
OD490 | Proliferation rate/% |
| Control | 5.5 | 0.276±0.016 | 100.00 |
| HG | 10 | 0.278±0.020 | 100.79 |
| 20 | 0.291±0.038 | 105.50 | |
| 25 | 0.541±0.277** | 196.07 | |
| 30 | 0.572±0.226** | 207.56 | |
| 50 | 0.571±0.321** | 207.25 | |
| **P < 0.01 vs control | |||
根据Tab 1结果，应用25 mmol·L-1葡萄糖作用12、24及48 h，结果(Tab 2)显示，作用24 h时CFs增殖率最高，达到204.6%(P < 0.01)，本实验确定高糖作用时间为24 h。
| Group | Time /h |
OD490 | Proliferation rate/% |
| Control | 12 | 0.267±0.026 | 100.00 |
| HG | 12 | 0.294±0.022 | 110.11 |
| Control | 24 | 0.304±0.019 | 100.00 |
| HG | 24 | 0.623±0.019** | 204.60 |
| Control | 48 | 0.397±0.027 | 100.00 |
| HG | 48 | 0.503±0.044** | 126.80 |
| **P < 0.01 vs control | |||
B对CFs增殖的影响CCK-8结果(Tab 3)显示，与Control组相比，MG组CFs无明显变化，提示高渗透压对CFs增殖无明显影响，而25 mmol·L-1高糖作用可促进CFs增殖(P < 0.01)；与HG组相比，经不同剂量(12.5、25、50 μmol·L-1)Sal B干预，对CFs增殖均出现抑制作用(P < 0.05)，25 μmol·L-1差异具有极显著性(P < 0.01)，后续实验选取Sal B的给药浓度为25 μmol·L-1。
| Group | Concentration /mmol·L-1 |
OD490 | Proliferation rate/% |
| Control | 0.307±0.021 | 100.00 | |
| MG | 0.306±0.029 | 99.78 | |
| HG | 0.595±0.010** | 193.71 | |
| HG+Sal B | 12.5 | 0.560±0.033# | 182.15 |
| 25 | 0.374±0.023## | 121.60 | |
| 50 | 0.363±0.009## | 118.18 | |
| **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG | |||
天狼猩红染色(Fig 1)显示：倒置显微镜下，胶原纤维为粉红色，细胞核为紫红色。与Control组相比，HG组细胞数量增多，红色胶原面积明显增加。与HG组相比，经Sal B以及XAV939预处理后，红色胶原面积减少，细胞间隙变大；单独应用Sal B及XAV939对CFs胶原纤维表达无明显影响。表明Sal B可通过抑制Wnt/β-catenin信号途径减少高糖诱导CFs胶原沉积。
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| 图 1 Effects of Sal B on expression of collagen fiber in CFs induced by high glucose(400×) A：Control group; B：HG group; C：HG + Sal B group; D：HG + XAV939 group; E：XAV939 group; F：Sal B group |
免疫荧光(Fig 2)显示：红色荧光代表α-SMA，蓝色荧光为细胞核，与Control组相比，HG组细胞红色荧光明显增强；与HG组相比，经Sal B(25 μmol·L-1)以及XAV939预处理后，红色荧光强度明显减弱；单独Sal B组及单独XAV939组与Control组相比荧光强度变化不明显。
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| 图 2 Effect of Sal B on expression of α-SMA in CFs induced by high glucose(400 ×) |
Western blot(Fig 3)显示：与Control组相比，HG组α-SMA蛋白表达明显增加(P < 0.01)；与HG组相比，HG+XAV939组与HG+Sal B组α-SMA蛋白水平降低(P < 0.01)，HG+XAV939组降低更为明显；单独Sal B组及单独XAV939组与Control组相比无明显变化。α-SMA为肌成纤维细胞的标志性蛋白，提示高糖可诱导CFs转分化为肌成纤维细胞，Sal B以及抑制Wnt/β-catenin信号可阻止高糖诱导CFs转分化程度。
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| 图 3 Effects of Sal B on expression of α-SMA, β-catenin and p-GSK 3β in CFs induced by high glucose(x±s, n=3) 1：Control group; 2：HG group; 3：HG + Sal B group; 4：HG + XAV939 group; 5：XAV939 group; 6：Sal B group; **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs HG group |
Western blot(Fig 3)显示：与Control组相比，HG组β-catenin、p-GSK 3β蛋白表达明显增加(P < 0.01)；与HG组相比，HG+XAV939组与HG+Sal B组β-catenin、p-GSK 3β蛋白水平降低(P < 0.01)，HG+XAV939组降低更为明显；单独Sal B组及单独XAV939组与Control组相比无明显变化。表明Sal B可通过下调β-catenin、p-GSK 3β表达抑制高糖诱导CFs增殖及转分化程度。
3 讨论CFs是心肌间质的主要细胞成分，糖尿病状态下CFs增殖可合成大量胶原，ECM合成增加，导致心肌间质纤维化。然而，单纯CFs增殖不足以完成纤维化进程，CFs转分化(即CFs转分化为肌成纤维细胞)则是心肌间质纤维化进展的关键所在，转分化作用可导致ECM合成级联放大，从而加重心肌间质纤维化及心脏重构的病理进程[7]。α-SMA是肌成纤维细胞特征性标志物，本研究中应用高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)诱导，CFs增殖率显著升高，α-SMA表达增加，胶原纤维增多；证实高糖可诱导CFs增殖转分化为肌成纤维细胞，特征性α-SMA表达增加，与Tao等[8]报道一致。实验中经Sal B(25 μmol·L-1)预处理后，明显抑制了CFs增殖及胶原纤维沉积，α-SMA表达明显减少，提示Sal B对高糖诱导CFs增殖及转分化有一定的抑制作用。
Wnt/β-catenin信号通路是调控组织器官发育的重要途径，参与细胞增殖、迁移及间质转化等过程。其中β-catenin在细胞内的数量与状态对该途径起决定作用，β-catenin在胞质中积累后进入细胞核，是Wnt信号传递的重要环节，β-catenin异常激活参与纤维增生疾病的发生发展[9]。刘理静等[1]研究显示，高糖可通过激活β-catenin引起肺成纤维细胞增殖及胶原合成。也有研究显示，持续血糖可通过激活Wnt/β-catenin/TCF7L2通路，使β-catenin活化参与糖尿病心肌病的病理生理过程[4, 10]。本研究中，高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)诱导，CFs内β-catenin表达明显增加，经Sal B及XAV939预处理后，β-catenin表达明显减少。提示Sal B可抑制高糖诱导CFs增殖转分化，其作用与下调β-catenin表达有关。
正常情况下，β-catenin受多种蛋白调控，GSK 3β为其负向调节因素。当无Wnt配体时，GSK 3β的调控作用使胞质内β-catenin处于较低水平；当有Wnt配体时，Wnt配体与膜上Frizzled及LRP5/6受体结合，形成复合物，激活胞内的Dsh，从而抑制GSK 3β活性，阻止胞质内β-catenin的降解；当GSK 3β的N端9位丝氨酸被磷酸化后，p-GSK 3β增加，降低了GSK 3β活性，从而导致胞质β-catenin过度表达[11]。有学者在小鼠肾间质纤维化的研究中发现，p-GSK 3β水平与β-catenin表达同步增加[12]；Liu等[13]发现，Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病诱导的心肌损伤中被激活，推测其与糖尿病诱导的心肌病变的发生有关。本研究中，高糖诱导CFs内p-GSK 3β与β-catenin亦出现同步增加；经Sal B及Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939预处理后，p-GSK 3β、β-catenin表达出现同步下调；提示GSK 3β磷酸化，可上调β-catenin表达，使α-SMA表达增多，促进高糖诱导CFs增殖及转分化；Sal B可通过下调p-GSK 3β、β-catenin表达抑制高糖诱导CFs细胞增殖及转分化过程。
综上所述，高糖作用CFs可上调p-GSK 3β与β-catenin表达，促进CFs增殖、转分化；Sal B可有效抑制高糖诱导CFs增殖及转分化作用，其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
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