脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是严重影响缺血性脑血管病溶栓治疗效果的重要病理过程，其发生机制十分复杂，氧化应激损伤和氧自由基连锁反应是脑缺血/再灌注引起二次损伤的关键因素[1]。自噬(autophagy)是细胞在应激条件下的一种自我保护过程，可将损伤的生物大分子或细胞器及时包裹、分解，产生新的能量物质，供细胞循环再利用，从而维持细胞自身稳态[2]。大量研究发现[3]，脑缺血/再灌注损伤可诱导自噬的发生，而激活自噬又可以减轻CIRI，提高神经元存活，发挥保护作用。中药黄芪是临床常用补气要药，因其补气又兼活血之功，使气盛则血行，瘀去而经脉通畅，目前在治疗缺血性脑血管病方面效果明显。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST)是黄芪的代表性活性单体成分，具有抗凋亡、抗衰老、抗病毒、抗炎等药理作用[4-5]。本课题组前期细胞和动物实验均证实，黄芪甲苷可上调自噬，减轻CIRI[6-7]，但其作用机制尚未完全阐明。本研究以在神经系统疾病体外研究应用广泛的PC12细胞(类神经元)为实验对象，在细胞水平，从自噬和氧化应激角度，探讨黄芪甲苷拮抗CIRI的作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞PC12细胞，亦称为类神经元，经过NGF生长因子处理后具有神经元的生理特性，购买于BOSTER公司。
1.2 试剂和仪器主要试剂：黄芪甲苷购买于上海士峰生物公司，规格为20 mg/瓶，纯度≥98%，生产批号为15082136；DMEM培养基(高糖)由Gibco公司生产；胎牛血清由杭州四季青生物公司生产；Earle’s平衡盐溶液(无糖)由LEAGENE公司生产；胰蛋白酶、PBS缓冲液、青链霉素混合液由北京索莱宝生物公司生产；自噬抑制剂3-MA由Sigma公司生产；MDC法自噬检测试剂盒购买于江苏凯基生物公司；CCK-8试剂盒、ELISA试剂盒购买于北京庄盟国际生物公司；Beclin1兔抗大鼠单克隆抗体购买于Abcam公司。主要仪器：普通细胞培养箱3111型、三气低氧培养箱3131型、多功能全波长读数仪Varioskan LUX型由Thermo公司生产；透射电子显微镜H-7650型由HITACHI公司生产；全电动倒置荧光显微镜Axio Observer 7型由Zeiss公司生产。
1.3 细胞培养PC12细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基(高糖)培养，细胞置于普通培养箱(CO2培养箱)内正常培养，每3 d换液1次，细胞密度生长至70%~80%传代。
1.4 氧糖剥夺/复氧复糖模型建立和实验分组将对数期PC12细胞分为4组：正常组(Normal)、模型组(氧糖剥夺/复氧复糖组，Model)、黄芪甲苷组(AST)、自噬抑制剂+黄芪甲苷组(3-MA+ AST)。除了正常组之外，其余3组均需建立氧糖剥夺/复氧复糖模型：各组细胞弃去正常培养基(DMEM高糖培养基，含10%的胎牛血清)，换为Earle’s培养基(无糖)，模拟细胞缺血状态，并将细胞立即放入三气低氧培养箱(1%O2+94%N2+5%CO2，湿度适宜，37 ℃)，氧糖剥夺3 h。随后，将细胞取出，更换培养基为正常细胞培养基，并将细胞放入普通培养箱继续培养(即复氧复糖)12 h。其中，黄芪甲苷组、自噬抑制剂+黄芪甲苷组在复氧复糖开始的同时分别予以黄芪甲苷和自噬抑制剂3-MA +黄芪甲苷处理，黄芪甲苷作用浓度为100 μmol·L-1，自噬抑制剂3-MA作用浓度为5 mmol·L-1；正常组不做其他处理，正常培养即可。
1.5 CCK-8法检测细胞活性将细胞以1×105个/mL密度接种至96孔板，普通培养箱培养24 h后，进行氧糖剥夺/复氧复糖造模和给药处理。随后，参照CCK-8试剂盒说明书步骤，给予CCK-8处理，普通培养箱孵育1 h。多功能全波长读数仪(波长调整为490 nm)检测各孔细胞吸光度值(即OD值)，OD值越大说明细胞活性越高。
1.6 ELISA法检测MDA含量、SOD和GSH-Px活性将细胞以1×105个/mL密度接种至96孔板，普通培养箱培养24 h后，进行造模和给药处理。随后，对各组细胞消化、离心、PBS清洗，收集各组细胞，4 ℃条件下将细胞机械匀浆，离心，取各组细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书步骤，检测各组细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活性。多功能全波长读数仪(波长调整为450 nm)检测各孔细胞OD值。用标准物浓度和OD值绘制标准曲线，建立直线回归方程式，计算各组细胞MDA、SOD、GSH-Px浓度。
1.7 透射电镜观察自噬小体变化对各组细胞消化、离心(1 000 r·min-1)、PBS清洗3次，随后用2.5%的戊二醛对细胞进行固定4 h，清洗细胞3次。然后用1%的饿酸对细胞进行固定2 h，50%、70%、80%、90%、100%不同浓度的丙酮对细胞进行脱水2遍，包埋剂与丙酮不同比例渗透细胞，37 ℃和60 ℃恒温箱对细胞进行聚合处理。超薄切片机切片(厚度为50 nm/片)，醋酸铀和酸铅双染切片。透射电镜观察自噬小体，拍照，计算单位面积(μm2)自噬小体数量。
1.8 MDC荧光染色检测自噬小体变化将细胞以1×105个/mL密度接种至24孔板，普通培养箱培养24 h，氧糖剥夺/复氧复糖造模和给药处理。随后，4%的多聚甲醛对细胞进行固定25 min，PBS清洗细胞3次，1×wash buffer清洗细胞3次。各孔加入MDC工作液100 μL，避光、室温反应45 min，1×wash buffer清洗细胞3次。倒置荧光显微镜观察自噬小体(即荧光斑点)，拍照，计算单位面积(mm2)荧光斑点数量，荧光斑点数量越多说明自噬小体越多、自噬活动越强。
1.9 Western blot检测Beclin1蛋白表达细胞裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，测定各组细胞蛋白含量。取60 μg样品，加入Buffer缓冲液，混匀。100 ℃沸水处理10 min，蛋白变性。凝胶电泳分离，蛋白转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h。随后，加入Beclin1兔抗大鼠单克隆抗体(封闭液稀释，1 :1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜液清洗3次(10 min/次)，加入二抗(1 :5 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜液清洗3次，ECL化学发光显色。β-actin作为内参。UVP软件采集图片结果，Image J软件计算各组灰度值。
1.10 统计学分析用SPSS19.0统计软件进行分析。数据用x±s表示，多组间比较用单因素方差分析。
2 结果 2.1 黄芪甲苷对PC12细胞活性的影响与正常组相比，模型组细胞活性显著降低(P < 0.05)，表明细胞损伤较为明显；与模型组相比，黄芪甲苷组细胞活性升高(P < 0.05)，差异有统计学意义；自噬抑制剂可明显拮抗黄芪甲苷提高细胞活性的作用(P < 0.05)。见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of astragaloside Ⅳ on viability of PC12 cells (x±s, n=6) A: Normal; B: Model; C: AST; D: 3-MA+AST. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs AST group |
与正常组相比，模型组MDA含量增多、SOD和GSH-Px活性下降(P < 0.05)，提示有明显的氧化应激损伤；与模型组相比，黄芪甲苷组MDA含量减少、SOD和GSH-Px活性升高(P < 0.05)，差异有统计学意义；自噬抑制剂可明显拮抗黄芪甲苷降低MDA含量、提高SOD和GSH-Px活性的作用(P < 0.05)。见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of astragaloside Ⅳ on MDA, SOD, GSH-Px of PC12 cells (x±s, n=6) A: Normal; B: Model; C: AST; D: 3-MA+AST. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs AST group. |
正常组未见自噬小体；模型组可见典型双层膜结构的自噬小体，表明自噬被激活；与模型组相比，黄芪甲苷组自噬小体数量增多，差异有统计学意义(P < 0.05)；自噬抑制剂可明显拮抗黄芪甲苷提高自噬小体数量的作用(P < 0.05)。见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagosomes of PC12 cells (x±s, n=6) A: Normal; B: Model; C: AST; D: 3-MA+AST. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs AST group. The arrows refer to autophagosomes. |
正常组自噬荧光斑点不明显；模型组自噬荧光斑点数量增多(P < 0.05)，提示自噬被激活；与模型组相比，黄芪甲苷组自噬荧光斑点数量增多(P < 0.05)，差异有统计学意义；自噬抑制剂可明显拮抗黄芪甲苷提高自噬荧光斑点数量的作用(P < 0.05)。见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of astragaloside Ⅳ on autophagic fluorescent spots of PC12 cells (x±s, n=6) A: Normal; B: Model; C: AST; D: 3-MA+AST. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs AST group. The arrows refer to autophagosomes. |
与正常组相比，模型组自噬标志蛋白Beclin1表达增多(P < 0.05)；与模型组相比，黄芪甲苷组Beclin1蛋白表达增多，差异有统计学意义(P < 0.05)；自噬抑制剂可明显拮抗黄芪甲苷提高Beclin1蛋白表达的作用(P < 0.05)。见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of astragaloside Ⅳ on Beclin1 protein expression of PC12 cells(x±s, n=6) A: Normal; B: Model; C: AST; D: 3-MA+AST. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs AST group. |
缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease)是一类常见的脑血管疾病，具有发病率高、致残和致死率高的特点，其发病已逐渐呈现年轻化的趋势，严重影响人类健康和生活。脑缺血/再灌注损伤是针对缺血性脑血管病恢复或重建缺血区血液灌注时而出现的一类重要病理损伤。脑缺血发生后，及时恢复缺血脑组织血流，再灌注可有效减轻脑组织损伤和神经功能障碍，但是再灌注期间可产生大量的活性氧，引起超氧化物自由基、羟基自由基、过氧化氢等增多，造成DNA损伤、蛋白质和脂质氧化，最终引起或加重神经元损伤[8]。活性氧极易侵袭细胞膜上的脂质，导致脂质发生过氧化，产生大量脂质过氧化物，引起细胞膜通透性、结构和功能发生改变。丙二醛(malonaldehyde，MDA)作为脂质过氧化反应的最终产物，被认为是检测氧化应激损伤的重要参考指标[9]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是一种重要的抗氧化酶，可阻止脂质发生过氧化，并促进H2O2分解为无毒害作用的H2O，保护细胞膜的结构和功能[10]。超氧化物歧化酶(SOD)作为清除活性氧的主要酶类，可直接反映细胞的抗氧化能力。SOD能够促进细胞内超氧阴离子和氢离子发生反应，生成O2和H2O2，其中H2O2在GSH-Px的作用下可分解成O2和H2O，从而有效抵抗氧化应激损伤[11]。
自噬是真核生物细胞在不断进化过程中的一种高度保守的重要分解代谢过程。为实现细胞本身代谢需要和维持内环境稳态，细胞内脱落的内质网膜或高尔基体膜可将老化、受损或异常的生物大分子和细胞器包裹，形成双层膜结构的自噬小体，最终在溶酶体的降解作用下，产生新的能量物质，供细胞循环再利用。
由于被降解的生物大分子和细胞器转运到溶酶体的方式不同，可将自噬分为3种类型：微自噬、巨自噬、分子伴侣介导的自噬，而巨自噬目前研究最为广泛和深入。细胞自噬受多种自噬相关基因的调控，其中Beclin1基因是调控自噬的特异性基因。Beclin1基因亦称为BECN1基因，是酵母菌ATG6基因在哺乳类生物中的同系物，有4个结构域：BH3结构域、进化保守结构域、卷曲螺旋结构域、核输出结构域。Beclin1基因可通过这些结构域形成相应复合体，诱导其他自噬基因定位在自噬体膜，调控自噬小体的形成，介导自噬活动。因此，Beclin1基因和自噬小体常作为检测自噬活动的重要依据。大量研究证实，脑缺血/再灌注可诱导Beclin1表达增多，促进自噬小体形成；应用自噬抑制剂3-MA处理后，Beclin1表达减少，自噬小体数量减少，神经元存活率升高，提示自噬可拮抗脑缺血/再灌注损伤[12-13]。
中药黄芪最早记载于《神农本草经》，有补气药中“耆长”、“补气诸药之最”的美誉，收录于历版《中华人民共和国药典》和全国统编《中药学》规划教材。大量文献记载，黄芪不仅具有补气的功效，还具有活血化瘀、通络止痛的作用，在治疗缺血性脑血管病方面效果良好，应用广泛。中国中药化学成分数据库显示，黄芪的化学成分包括黄芪皂苷、黄芪黄酮、黄芪多糖、氨基酸、微量元素等70余种有效物质成分。黄芪甲苷是黄芪皂苷中的代表性活性单体成分，具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、抗病毒、促进能量代谢和干细胞增殖等生物作用，是检测黄芪质量优劣的重要参考指标[14-15]。本课题组一直致力于黄芪及其有效成分防治缺血性脑血管病方面的研究。我们前期研究发现，黄芪甲苷可通过上调自噬抑制脑缺血/再灌注损伤，发挥神经保护作用，但其作用机制尚未完全阐明，亟待明确。本实验以PC12细胞作为研究对象，通过氧糖剥夺/复氧复糖模型模拟建立神经元体外缺血/再灌注损伤，在细胞水平，从调控自噬和氧化应激角度，探讨黄芪甲苷拮抗脑缺血/再灌注损伤的具体作用机制。实验结果发现，氧糖剥夺/复氧复糖可诱导自噬激活，同时也引起了氧化应激损伤；当黄芪甲苷干预后，自噬活动增强，氧化应激损伤减轻，提示黄芪甲苷可上调自噬，并抑制氧化应激损伤；当自噬抑制剂3-MA、黄芪甲苷同时干预，自噬活动变弱，氧化应激损伤加重，表明黄芪甲苷可通过上调自噬，减轻氧糖剥夺/复氧复糖诱导的PC12细胞氧化应激损伤，发挥保护作用。
最后，需要指出的是，自噬具有“双刃剑”的作用，自噬过度激活可引起自噬性细胞损伤甚至死亡，这可能与疾病的发展过程、损伤程度、干预条件、预后转归等因素有关，因此如何更加全面地认识自噬，精准地调节自噬，充分发挥其保护作用，将是我们进一步努力和探索的方向。
( 致谢: 本实验在河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室完成，谢谢！)
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