2. 湖北民族大学医学部病理教研室, 湖北 恩施 445000;
3. 生物资源保护与利用湖北省重点实验室, 湖北 恩施 445000;
4. 恩施州中心血站, 湖北 恩施 445000
2. Dept of Pathology, Medical School of Hubei Minzu University, Enshi Hubei 445000, China;
3. Key Lab of Biological Resource Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi Hubei 445000, China;
4. Blood Bank Center of Enshi, Enshi Hubei 445000, China
随着人口老龄化的加剧, 与衰老相关的疾病逐渐成为人类健康的大敌, 如神经系统疾病、癌症等受到广泛的关注和重视。研究发现, 微小RNA(miRNA)参与细胞凋亡及衰老等多种生命过程[1], 其中miR-155是一个多功能miRNA, 在肺、心、脑及肾脏表达较丰富[2], 通过和靶基因Rheb(Ras homolog enriched in brain, Rheb)的3'UTR相结合, 负向调控细胞自噬[3, 4]。提高Rheb表达水平可以激活mTORC1(mammalian target of rapamycin C1, mTORC1)的活性, 对延缓衰老具有重要作用[5]。头顶一颗珠(Trillium tschonoskii Maxim, TTM)系百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎, 其主要成分为延龄草苷, 具有抗氧化和保护神经损伤作用[6, 7]; 亦可通过上调睫状神经营养因子和其受体的表达来保护脊髓损伤[8]。为深入探讨延龄草苷延缓衰老的机制, 本研究采用大鼠皮下注射D-半乳糖法构建大脑衰老模型, 评估miR-155/Rheb/mTOR信号通路中的相关基因、蛋白质的表达来证实我们的假设, 以期为延缓衰老相关疾病提供潜在的靶向药。
1 材料与方法 1.1 药物和试剂头顶一颗珠提取物延龄草苷(CAS No.14144-6-0, Bellancom)购自北京寰宇科创有限公司, 纯度大于98%。D-半乳糖(D-Galactose, D-gal)购自美国Sigma-Aldrich有限公司。一抗mTOR, p-mTOR购自美国Cell Signaling Technology公司; Rheb, 8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHDG)购自美国Sigma公司; 其余Western blot相关试剂购自上海碧云天公司。
1.2 动物分组和处理50只SD大鼠, ♂, 体质量(220±20)g, 由湖北省实验动物研究中心提供, ,许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。实验接受湖北民族大学动物伦理委员会的监督。随机分为5组, 每组10只。正常组, 常规喂养; D-gal组, 皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg·d-1); TTM组, 皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg·d-1), 并给予50 mg·kg·d-1、100 mg·kg·d-1和200 mg·kg·d-1 TTM灌胃, 共6周, 常规喂养, 自由饮水。
1.3 行为学测试定位航行测试, 在大鼠入水时采集信号, 大鼠成功上台, 且在平台上停留时间超过10 s, 记录总路程、潜伏期、平均速度等。空间探索实验记录1 min内大鼠穿越原有平台的次数。Morris水迷宫完成24 h后, 麻醉, 每组选5只大鼠, 先用0.9%生理盐水经心脏行主动脉灌洗, 并用4%中性多聚甲醛灌注固定。剩余大鼠灌流后取海马, -80 ℃冰箱中保存备用。
1.4 HE、Nissl及8-OHdG和Rheb染色脑组织常规切片, 行HE及Nissl染色, 观察海马CA1区神经元形态及Nissl小体情况。
免疫荧光染色:抗原修复后用BSA封闭, 滴加8-OHdG(1 :250)和Rheb(1 :300)抗体, 4 ℃冰箱过夜, 加入二抗(1 :1 000), DAPI染核, Nikon 80i荧光显微镜下观察并采集图像。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5 Real-time PCR法检测miR-155-3p水平取海马组织, 采用miRNA Purification Kit miRNA提取试剂盒(Tiangen), 提取其miRNA(具体步骤参照说明书进行)。引物设计与合成在miRBase数据库(http://www.mirbase.org)和GenBank查找基因序列, 使用软件Primer 5进行引物设计, 并将所得引物进行合成(生工生物工程(上海)有限公司合成)。miRNA-155-3p基因引物序列:CCTCCTACCTGTTAGCATTAAC。miRNA逆转录和real time RT-PCR选用U6 snRNA作为内参。整个扩增反应体系参照miRNA Real-Time PCR Assay Kit(SuperReal PreMix Plus(SYBR GREEN))试剂说明书进行。miRNA的逆转录选用miRNA第一链cDNA合成(加尾法), Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行。反应条件:95 ℃, 15 min预变性, 95 ℃ 10 s变性, 60 ℃ 30 s退火/延伸, 40个循环。标本均作复管PCR反应, 重复3次。miRNA-155-3p表达采用2-△△Ct法计算其相对表达量。△Ct=Ct(miRNA)-Ct(U6), △△Ct=△Ct实验-△Ct对照。实验数据由美国安捷伦Mx3005P实时荧光定量系统自动采集分析。
1.6 海马组织蛋白的提取及WB检测取海马加入裂解液和蛋白磷酸酶抑制剂及PMSF, 冰上匀浆, 离心(4 ℃, 12 000 r·min-1, 15 min), BCA法测定蛋白浓度, SDS-PAGE凝胶电泳, 冰浴转膜, 加一抗Rheb(1 :500)、mTOR, p-mTOR, β-actin(1 :1 000)4 ℃孵育过夜, 加二抗(HRP标记的羊抗兔IgG, 1 :5 000)/(HRP标记的羊抗鼠IgG), 室温孵育4 h后TBST洗膜, LAS 4000 mini凝胶成像系统显影并分析。
1.7 统计学分析所有数据用x±s表示, 结果用单因素方差分析和t检验进行分析处理。
2 结果 2.1 TTM对D-半乳糖所致衰老大鼠学习能力的影响定位航行实验中, 5组大鼠逃避潜伏期、路程长度呈缩短趋势(Fig 1 Ai、Fig 1 Bi); 定位航行训练第1~2天, 各组之间差异无显著性。d5, D-gal组大鼠平均逃避潜伏期和路程长度均比正常对照组和TTM组长(P＜0.01;P＜0.05;Fig 1Aii、Fig 1Bii)。5组大鼠游泳速度没有明显差别(Fig 1 Ci, Fig 1 Cii)。
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| Fig 1 D-gal induced spatial memory retention dysfunction in rats prevented by TTM (x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group, #P < 0.05 vs D-gal group |
空间探索实验中, 穿越平台次数D-gal组明显少于正常对照组和TTM组(P＜0.05, Fig 1D), 提示与正常组大鼠相比, D-gal组大鼠记忆能力有所下降, 而TTM组大鼠则有明显的改善(Fig 1E)。
2.2 TTM对D-半乳糖所致衰老大鼠海马结构的影响HE染色显示, D-gal组神经元层次减少, 排列不规则, 细胞核淡染; TTM组比D-gal组改变要轻(Fig 2A)。
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| Fig 2 Effects of TTM on D-gal induced tissue structure, Nissl bodies and 8-OHdG in SD rat hippocampus A: HE staining, ×400; B: Nissl's staining, ×400; C: Immunofluorescence staining of 8-OHdG, ×400; D: Immunofluorescence staining results of 8-OHdG (x±s, n=5). **P < 0.01 vs control group, #P < 0.05 ##P < 0.01 vs D-gal group |
尼氏染色显示D-gal组尼氏小体颗粒明显减少, TTM组尼氏小体较模型组增多(Fig 2B)。
免疫荧光染色结果显示, 8-OHdG主要分布于海马神经元突起和胞体, D-gal组荧光分布比正常组和TTM组的密集、亮度更高(Fig 2C); D-gal组免疫荧光MOD值明显高于正常组(P＜0.01), 而TTM组低于D-gal组(P＜0.05)(Fig 2D)。
2.3 TTM对D-半乳糖所致衰老大鼠海马组织中miR-155-3P水平的影响Real-time PCR结果显示, D-gal组miR-155-3P表达水平比正常组升高(P＜0.05)。而TTM处理组的miR-155-3P表达上调得到明显的缓解(P＜0.05)(Fig 3), 提示miR-155-3P表达上调与D-gal诱导的老化有密切关系, TTM有抑制其表达上调的作用。
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| Fig 3 Effects of TTM on D-gal induced miR-155-3P in SD rat hippocampus (x±s, n=5) *P < 0.05 vs control group, #P < 0.05 ##P < 0.01 vs D-gal group |
Western blot结果显示, 与正常组相比, D-gal组大鼠海马内Rheb、p70S6K表达下调, TTM处理可上调其表达(P＜0.01, P＜0.05)。与正常对照组比较, D-gal处理组内p-mTOR/mTOR水平增加(P＜0.05), 而TTM处理后能够明显抑制D-gal所致的mTOR活化(P＜0.05)(Fig 4)。
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Fig 4 Effects of TTM on D-gal induced Rheb, p70S6k, mTOR in SD rat hippocampus (x±s, n=5)
A:Immunofluorescence staining of Rheb, ×400; B:Western blot research showed the level of Rheb, p70S6K, mTOR; C: Results of Rheb, p70S6K, mTOR *P < 0.05, **P < 0.01vs control group, #P < 0.05, ##P < 0.01vs D-gal group |
脑衰老过程中引起一些行为改变, 如学习和记忆等认知能力的下降[9]。研究发现D-gal会导致机体氧化应激水平增高、抗氧化功能下降, 促使脑的退行性改变[10]。因此给予D-gal注射被认为是一种理想的脑衰老模型的构建方法, 广泛用于衰老相关研究中[11]。水迷宫实验结果发现注射D-半乳糖可降低大鼠空间学习及记忆能力, 而不同剂量TTM干预可改善其空间认知功能障碍及提高定向航行能力, 有一定剂量依赖性, 表明TTM能有效改善衰老大鼠认知功能障碍。
研究发现, miRNA广泛参与到神经系统生长发育及相关疾病的发生发展过程中, 包括神经元生长、突触可塑性等方面均有miRNA在转录后水平对基因表达的调控作用[12]。其中miRNA-155广泛参与到免疫及炎症性疾病中, 脑退行性病变的发生发展与免疫及炎症密切相关, 因而推测miRNA-155可能是其治疗的靶点[13]。基于这些研究发现, 我们分析了miR-155-3p在D-半乳糖诱导的脑衰老大鼠模型中的表达, 发现D-半乳糖皮下注射可引起大鼠海马组织内miR-155-3p水平增加, 而TTM干预可逆转D-半乳糖所诱导的miR-155-3p水平的改变。
Rheb是Ras同源基因, 表达于各种哺乳动物体内, 是miR-155-3p的靶基因之一, 可能参与调控机体自噬进而延缓衰老[14]。研究显示, 在神经系统中Rheb过表达会促进轴突的生长、影响神经元棘突形成[15]。因此, 我们采用蛋白免疫印迹技术进一步检测海马组织内Rheb通路相关蛋白的表达, 发现D-半乳糖诱导可降低海马内Rheb和p70S6k的水平、增加mTOR磷酸化, 表明衰老大鼠脑组织内Rheb通路出现抑制; 而不同剂量TTM干预可上调D-半乳糖诱导的Rheb和p70S6k水平的降低、抑制p-mTOR表达, 表明TTM抗衰老作用可能与调控Rheb/mTOR/p70S6k信号通路有关。但TTM是否通过下调miR-155-3p来激活该通路发挥抗衰老作用还有待深入研究证实。
综上所述, 我们研究发现, TTM干预可下调D-半乳糖诱导的海马内miR-155-3p水平增加、调控Rheb/mTOR/p70S6k信号通路, 改善D-半乳糖诱导大鼠的认知障碍, 从而发挥抗衰老作用, 这可能为延龄草苷干预衰老相关疾病提供一定的理论基础, 为开发和利用天然产物在促进健康和疾病治疗提供参考, 但其作用机制有待深入研究。
( 致谢: 本实验在湖北民族大学医学部病理学研究所实验室完成, 感谢课题组成员的支持与协助 )
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