2. 西南医科大学附属中医医院 中西医结合研究中心，四川 泸州 646000;
3. 成都医学院，四川 成都 610000
2. Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine, the Affiliated Hospital of Traditional ChineseMedicine, Southwest Medical University, Luzhou Sichuan 646000, China;
3. Chengdu Medical College, Chengdu 610000, China
慢性肾脏(chronic kidney disease，CKD)作为一个全球的重要公共卫生问题, 严重威胁着公众健康[1]。而纤维化是导致终末期器官疾病(包括慢性肾病)的标志和共同途径, 故抑制肾脏纤维化是延缓CKD病情发展的关键[2]。转化生长因子β1(TGF-β1)是一种促纤维化细胞因子, TGF-β通过与TGF-βⅡ型受体结合而启动其跨多种细胞类型的促纤维作用, 该受体激活TGF-βⅠ型受体, 导致Smad2/3的磷酸化, 然后激活的Smad3复合物易位到细胞核并调节促纤维化基因的转录, 如I型胶原蛋白(Col I)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，从而对CKD的进展发挥致纤维化作用[3, 4]。
目前尚无可用于减轻肾纤维发生和保持器官功能的治疗药物，抑制TGF-β/ Smad途径的替代方法可能是一种能有效减轻肾纤维化而又不损害免疫系统功能的重要选择[5]。Erbb4-IR是一种新的长非编码RNA(long noncoding RNA, ，lncRNA), 是TGF-β/Smad3信号传导的下游效应子, 由TGF-β1通过Smad3依赖性机制诱导, 并且在小鼠单侧输尿管梗阻性肾病(unilateral ureteral obstructive nephropathy，UUO)纤维化肾中高度上调。而Smad7是TGF-β/Smad信号传导的下游负调节因子。有研究发现, 用Smad3特异性抑制剂(SIS3)处理能够预防小鼠肾小管上皮细胞中TGF-β1诱导的Erbb4-IR表达，而Erbb4-IR的过表达在很大程度上可以抑制Smad7, 而沉默Erbb4-IR可以阻断TGF-β1诱导的胶原蛋白I和α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)在体外的表达, 可有效减轻肾脏纤维化[6-8]。紫草素(Shikonin，SHI)是从紫草根中提取的一种化合物, 具有抗氧化, 抗炎, 抗癌和促进伤口愈合的特性[9], 已有文献报道其对肝脏、肺纤维化有较好的治疗作用, 但关于其在肾脏纤维化中研究的文献报道较少。本研究拟观察紫草素对慢性肾脏纤维化小鼠的作用，并通过检测紫草素对TGF-β/Smad3/Erbb4-IR信号轴的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和环境SPF级C57BL/6小鼠购于成都达硕实验动物有限公司, 许可证号:SYXK(川)2018-065, 饲养于西南医科大学SPF级实验动物中心, 在温度22 ℃左右、湿度65%左右的环境中生长。
1.1.2 药物和试剂紫草素购于成都purify公司, GoScriptTM Reverse Transcription System(A5001)购于Promega公司, 抗体p-smad3(1 :1 000, 9520S)、Smad3(1 :1 000, 9513S)均购于CST, FN购于DSHB(1 :1 000, P1H11), Smad7购于Santa Cruz(1 :500, sc365846), α-SMA购于Invitrogen(AB-2572995), 高碘酸-希夫反应(periodic acid-Schiff stain, PAS)试剂盒购于Solarbio(Beijing, G1281), MASSON染色购于BASO(珠海, BA4079B), 肌酐测定试剂盒(C011-2)、尿素氮测试盒(C013-2)均购于南京建成。
1.1.3 主要仪器Light CyclerR 480II PCR仪, Thermo Fisher分光分度计, Thermo Fisher PCR仪, 仪器均来自美国Thermo Fisher公司。
1.2 方法 1.2.1 实验动物分组与处理将30只小鼠随机分为假手术组、UUO组、紫草素低(5 mg·kg-1)、高剂量组(20 mg·kg-1)、厄贝沙坦组(20 mg·kg-1)。除假手术组外, 其余各组均接受单侧输尿管结扎手术，在手术前1 h, 治疗组给予药物灌胃处理，以后每天给药1次, 10 d后处死，眼球取血，4 ℃过夜。剖取右肾，剥离包膜并用PBS冲洗，一部分肾组织放于冻存管中迅速置于液氮罐储存备分子生物学检测, 另一部分置于10 %甲醛溶液中固定保存, 脱水后制作成石蜡块。
1.2.2 血清肌酐尿素氮检测收集各组小鼠血，4 ℃放置过夜后, 3 000 rpm, 离心15 min后, 收集血清，血清肌酐、尿素氮检测按照说明书操作。
1.2.3 肾脏形态学检查切片于65 ℃烘箱烘烤1.5 h，梯度脱蜡复水。HE、PAS染色、MASSON染色严格按照说明书步骤操作。光镜下观察肾脏结构病理改变，MASSON染色观察肾组织的纤维化病变。肾小管损伤率计算公式：同一镜下肾小管损伤数与总肾小管数的比值, 此处我们取了6个镜下。
1.2.4 IHC和Western blot检测IHC检测α-SMA的表达：切片常规处理后, 滴加过氧化氢阻断剂10 min, 5%BSA封闭15 min, 滴加一抗(1 :150), 4 ℃过夜, 加二抗后常温孵育1 h, 曝光。各组肾脏剪碎后加RIPA和PMSF(1 :10)混合物在冰上裂解40 min后，取上清，考马斯亮蓝法测浓度，加5×loading buffer后于100 ℃煮10 min，等量蛋白液上样，经SDS-PAGE分离，用PVDF膜转膜，用5 % BSA封闭1 h后，孵一抗, 4 ℃过夜，HRP标记二抗摇床孵育1 h，以ECL发光液检测。
1.2.5 TGF-β和Erbb4-IR基因检测取各组肾脏组织40 mg, 用灭菌后的剪刀剪碎组织, 直至肉眼不可见大块组织, 运用RNA simple Total RNA Kit(Beijing Tian Gen，Q5905)试剂盒从肾中提取总RNA, 最后加入30 μL无RNA酶双蒸水, 混匀, Thermo Fisher NANODROP 2000分光分度计上检测RNA浓度, 按照Go ScriptTM Reverse Transcription System(Promego, A5001, USA)说明书进行逆转录操作。cDNA合成反应体系为：RNA 2 μg、Random Primer 1 μL、Primer Oligo(dT)1 μL、Nuclease-Free Water定容到5 μL, 混匀离心, 70 ℃ 5 min, 冰上放置5 min，离心10 s。使用Go ScriptTM逆转录系统的以下组分制备逆转录反应混合物, 反应体系组成为：5×Reaction Buffer 4 μL、MgCl2 (final concentration 2.5 mmol·L-1) 1.5 μL、PCR Nucleotide Mix 1 μL、Go Script TM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water 7.5 μL，轻轻混合, 并在逆转录之前保持在冰上。将cDNA 5 μL和逆转录体系15 μL混合在一起, 离心后25 ℃ 5 min, 42 ℃ 1 h, 70 ℃ 15 min，反应完毕加入80 μL Nuclease-Free Water稀释样品, -20 ℃保存备用。Light CyclerR 480 II上检测Erbb4-IR、TGF-β, 引物信息如表 1，靶基因的mRNA表达水平针对GAPDH标准化。
| Gene symbol | Primer sequence (5’ to 3’) |
| Erbb4-IR | |
| Forward sequence | AACTCGCCACAGAAATCCAC |
| Reverse sequence | ACAACCCCAAACAAGCTGTC |
| TGF-β | |
| Forward sequence | CTCCCGTGGCTTCTAGTGC |
| Reverse sequence | GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG |
| GAPDH | |
| Forward sequence | CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT |
| Reverse sequence | AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAG |
SPSS19.0统计软件分析, 数据采用单因素方差分析(ANOVA), 方差不齐时采用秩和检验。
2 结果 2.1 小鼠一般情况各组小鼠活动正常, 无死亡现象, 模型组小鼠体重较假手术组增长缓慢; 紫草素低、高剂量组及厄贝沙坦组小鼠体重相比模型组均有明显改善。
2.2 肌酐、尿素氮检测紫草素低、高剂量组的肌酐和尿素氮均有下降, 且高剂量组的尿素氮低于厄贝沙坦组, 差异有显著性。
2.3 肾组织结构改变HE染色可以看出, 模型组肾脏肾小管上皮细胞萎缩, 出现较多空泡, 无完整肾脏结构，且有较多炎性细胞出现, 紫草素的治疗可明显改善肾小管损伤状态, 空泡减少, 炎性细胞减少, 且紫草素高剂量组优于厄贝沙坦组。见Fig 1。
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| Fig 1 Renal function and renal pathological damage significantly improved by shikonin in UUO mice A: The creatinine of each group of mice was significantly different between the UUO model group and the high dose shikonin group; B: Detection of urea nitrogen in mice of each group, the UUO model group and the high dose of shikonin group were significantly different; C: The number of damaged renal tubules was examined in HE staining, and the renal tubular injury rate was calculated. The high dose of shikonin group was significantly different from the model group; D: The results for HE staining and PAS staining(x±s, n=6) 1.NC; 2.UUO; 3.UUO+SHI L; 4.UUO+SHI H; 5.Irbesartan.##P < 0.01 vs UUO group |
MASSON染色显示, UUO模型组蓝色纤维化区域较假手术组增多, 和模型组相比, 紫草素治疗组纤维组织成分明显减少。IHC结果显示, UUO组的α-SMA表达较假手术组增强; 紫草素高剂量组的α-SMA表达较UUO组明显减少。Western blot结果显示, UUO组α-SMA和FN蛋白明显增加, 紫草素治疗组其蛋白表达下降, 紫草素高剂量组表现更为明显。见Fig 2。
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| Fig 2 Renal fibrosis induced by UUO significantly reduced by shikonin in mice A: Western blot results of fibrosis markers α-SMA and FN. The results showed that the expression of α-SMA and FN was significantly decreased after the treatment of high dose of shikonin; B: MASSON staining showed that the expression of collagen fibers in the model group increased, and fibrosis was significantly reduced after treatment with shikonin. Immunohistochemistry showed that low and high doses of shikonin reduced the expression of α-SMA in different degrees(x±s, n=6) 1.NC; 2.UUO; 3.UUO+SHI L; 4.UUO+SHI H; 5.Irbesartan. ##P < 0.01 vs UUO group. |
Real-Time PCR结果显示, UUO组肾脏组织Erbb4-IR表达较假手术组增多, TGF-β的mRNA表达也明显增多。紫草素治疗低、高剂量组和厄贝沙坦组Erbb4-IR的表达较模型组减少, TGF-β mRNA表达也减少, 紫草素高剂量更为明显。p-Smad3蛋白在假手术组肾脏中表达极少, UUO成模10 d后，p-Smad3蛋白表达增多, 而Smad7蛋白表达下降。经过紫草素治疗后, p-smad3的表达下降, Smad7表达增高, 在紫草素高剂量组表现尤为明显。见Fig 3。
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| Fig 3 Fibrosis induced by UUO improved by shikonin in mice by reducing Smad3/Erbb4 axis A: The expression of TGF-β mRNA in kidney tissues of each group of mice, the high dose of shikonin can significantly reduce the expression of TGF-β mRNA; B: The expression of ERBB4-IR mRNA in kidney tissues of each group of mice significantly decreased by high dose of shikonin; C: Expression of p-Smad3 and Smad7 protein, Smad7 protein expression increased in shikonin treatment group, especially in high dose group and the expression of p-smad3 protein decreased(x±s, n=6). 1.NC; 2.UUO; 3.UUO+SHI L; 4.UUO+SHI H; 5.Irbesartan. ##P < 0.01 vs UUO group. |
肾纤维化是多种慢性疾病的一致病理转归，其发生机制复杂, 由于缺乏可用的治疗选择，终末期慢性肾病目前通过透析或移植肾替代疗法治疗。TGF-β1作为一种公认的促肾纤维化细胞因子，受到各种病理性因素(缺血、缺氧或高糖等)和外界环境诱导产生，可刺激成纤维细胞、MFB及EMT合成并分泌ECM[10, 11]。
紫草素, 一种来源于干燥的根中天然产物，有较好的抗纤维化作用。近年来有学者研究发现，紫草素可减轻α-SMA在人皮肤成纤维细胞中的表达[12]。本研究通过建立梗阻性肾病纤维化模型来探讨紫草素对肾纤维化的保护作用及其作用机制。研究结果显示在造模10 d后肾脏体积增加, 肾皮质变薄, 肾脏内积水较多，而紫草素治疗组可显著缓解肾脏病变, 病理结果也显示紫草素治疗组可显著缓解肾功能损伤, 改善肾小管损伤, 明显降低了α-SMA、FN蛋白的表达，改善了肾脏纤维化，提示紫草素具有一定的抗肾纤维化效果, 但具体机制尚不清楚。Smad3受TGF-β1刺激活化，是诱发纤维化的核心调控因子，但有研究表明，Smad3基因缺失可能破坏免疫系统而诱发自身免疫性疾病，因此，直接抑制Smad3可能并不是一种理想的缓解TGF-β1介导肾纤维化的方法，而调控Smad3信号转导(如抑制Smad3靶基因)可能是一种更佳的治疗策略。长链非编码RNA是一类长度>200个核苷酸、不编码蛋白的RNA分子，前期研究证实, lncRNA的异常表达与多种病理环境相关，比如癌症、代谢和心血管疾病。近期研究结果显示，通过使用高通量测序发现lncRNA在慢性肾病小鼠模型中具有差异表达, 与肾脏疾病发生发展有密切关系[13, 14]。研究发现Erbb4-IR是一种新的肾脏特异性Smad3依赖性长链非编码RNA，位于Erbb4基因的1号和2号外显子之间的内含子非编码RNA[6], 已被研究证明在肾脏纤维化、癌症以及细胞代谢中发挥重要作用。Erbb4-IR受Smad3活化后产生，是Smad3下游重要靶基因之一，其通过下调Smad7而作用于TGF-β/ Smad3介导的肾纤维化。因此，通过抑制长链非编码Erbb4-IR的表达进而减缓纤维化是一种有效的治疗方法。在本课题中我们发现Smad3蛋白磷酸化水平和长链非编码Erbb4-IR表达在UUO模型组中明显升高, 表明纤维化调控因子Smad3在UUO模型中已经被激活, 诱发了纤维化, 同时其下游靶基因Erbb4-IR也给予回复, smad3蛋白转录增加, 表达上调, 会竞争性与TβR-I结合, 反馈性地抑制Smad7的表达。在给药10天后，Smad3蛋白磷酸化水平表达明显下调，表明紫草素可以抑制纤维调控因子的表达，同理Smad7表达上调，说明紫草素可以通过平衡Smad3和Smad7而达到抑制纤维化的作用。值得注意的是，紫草素治疗后也可明显抑制Smad3下游靶基因Erbb4-IR的表达, 据此初步我们可以得出紫草素可以通过减少长链非编码RNA Erbb4-IR来抑制Smad3、促进Smad7的表达从而减轻肾脏纤维化, 这可能是紫草素保护CKD的新机制。但在本研究中，Erbb4-IR在肾脏损伤中的确切作用尚需细胞水平的验证，机制探讨也需进一步深入研究。
综上所述, 紫草素可通过降低Smad3下游靶基因Erbb4-IR的表达来抑制TGF-β/Smad3介导的肾脏纤维化，发挥良好的抗纤维化作用, 这对紫草素的肾保护机理与临床运用起到很好的指导作用。
| [1] |
Zhang L, Wang F, Wang L, et al. Prevalence of chronic kidney disease in China :a cross-sectional survey[J]. Lancet, 2012, 379(9818): 815-22. doi:10.1016/S0140-6736(12)60033-6 |
| [2] |
尹佳琦, 魏明刚, 黄星星, 等. 芪归益肾方通过调控miR-141对UUO小鼠肾脏纤维化的影响[J]. 中成药, 2018, 40(4): 765-70. Yin J Q, Wei M G, Huang X X, et al. Effect of Qigui Yishen Decoction on miR-141 regulation in UUO mice with renal fibrosis[J]. Chin Trad Patent Med, 2018, 40(4): 765-70. doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2018.04.001 |
| [3] |
欧阳艳, 罗军. TGF-β/Smads信号传导通路与肾脏纤维化[J]. 国际泌尿系统杂志, 2017, 37(2): 302-5. OuY Y, Luo J. TGF-β/Smads signaling pathway and renal fibrosis[J]. Inter J Urol Nephrol, 2017, 37(2): 302-5. doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4416.2017.02.040 |
| [4] |
贾会玉, 段陈方圆, 李莉, 等. 丹蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smads信号通路的调控作用[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(5): 714-20. Jia H Y, Duan Chen F Y, Li L, et al. Control of TGF-β1/Smads signaling pathwayin diabetic nephropathy rats by Danzhijiangtang capsule[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(5): 714-20. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.05.024 |
| [5] |
Leti Fat jon, Morrison Evan, DiStefano Johanna K. Long noncoding RNAs in the pathogenesis of diabetic kidney disease: implications for novel therapeutic strategies[J]. Per Med, 2017, 14(3): 271-8. doi:10.2217/pme-2016-0107 |
| [6] |
Sun S F, Tang Patrick M K, Feng M, et al. Novel lncRNA Erbb4-IR promotes diabetic kidney injury in mice by targeting miR-29b[J]. Diabetes, 2018, 67(4): 731-44. doi:10.2337/db17-0816 |
| [7] |
Feng M, Tang Patrick M K, Huang X R, et al. TGF-β mediates renal fibrosis via the Smad3-Erbb4-IR long noncoding RNA axis[J]. Mol Ther, 2018, 26(1): 148-61. doi:10.1016/j.ymthe.2017.09.024 |
| [8] |
Wang P, Luo M L, Song Erwei, et al. Long noncoding RNA inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway[J]. Sci Transl Med, 2018, 10(462): pii: eaat2039. doi:10.1126/scitranslmed.aat2039 |
| [9] |
张小方, 赵影, 李琦. 紫草素抑制非小细胞肺癌A549侵袭和迁移能力[J]. 中国免疫学杂志, 2019, 35(2): 197-201. Zhang X F, Zhao Y, Li Q. Shikonin suppresses invasion and migration of non-small cell lung cancer cells A549[J]. Chin J Immunol, 2019, 35(2): 197-201. |
| [10] |
曾锦江, 米华. TGF-β/Smad信号通路在肾纤维化中的研究进展[J]. 广东医学, 2017, 38(15): 2412-5. Zeng J J, Mi H. Research progress of TGF-β/Smad signaling pathway in renal fibrosis[J]. Guangdong Med, 2017, 38(15): 2412-5. doi:10.3969/j.issn.1001-9448.2017.15.046 |
| [11] |
杨洋, 张中文, 姚华, 等. 去乙酰化蛋白酶1在马兜铃酸肾纤维化模型中对TGF-β1/Smad7信号通路的作用[J]. 畜牧兽医学报, 2012, 43(3): 459-68. Yang Y, Zhang Z W, Yao H, et al. The role of HDAC1 in the signal pathway of TGF-β1/Smad7 in AAN model[J]. Chin J Ani Vet Sci, 2012, 43(3): 459-68. |
| [12] |
Liu T, Xu L, Wang C F, et al. Alleviation of hepatic fibrosis and autophagy via inhibition of transforming growth factor-β1/Smads pathway through shikonin[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2019, 34(1): 263-76. doi:10.1111/jgh.14299 |
| [13] |
Zeng F H, Miyazawa T, Kloepfer L A, et al. Erbb4 deletion accelerates renal fibrosis following renal injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2018, 314(5): F773-87. doi:10.1152/ajprenal.00260.2017 |
| [14] |
Zhou Q, Huang X R, Yu J W, et al. Long noncoding RNA Arid2-IR is a novel therapeutic target for renal inflammation[J]. Mol Ther, 2015, 23(6): 1034-43. doi:10.1038/mt.2015.31 |