2. 中南大学湘雅医学院生理学教研室，湖南 长沙 410000;
3. 南华大学公共卫生学院社会医学与卫生事业管理学教研室, 湖南 衡阳 421000
2. Dept of Physiology, Xiangya Medical College, Central South University, Changsha 410000, China;
3. Dept of Social Medicine and Health Management, School of Public Health, University of South China, Hengyang Hunan 421000, China
随着生活水平的提升以及生活方式的改变，肥胖人数呈现逐年上升的趋势[1]。肥胖不仅对人们的健康造成极大的危害，而且给国家及社会带来沉重的负担。因此，如何预防和治疗肥胖问题一直是科学界研究的热点。
文献报道脂肪组织在肥胖及其相关的疾病中具有重要作用。人体内存在两种不同类型的脂肪组织：白色脂肪组织和棕色脂肪组织[2]。研究显示：促进白色脂肪组织棕色化，能增加能量消耗从而有效抵抗肥胖。二氢杨梅素(DHM)为野生藤类黄酮类化合物，3, 5, 7, 3’, 4’, 5’-六羟基2, 3二氢黄酮醇，又名蛇葡萄素，存在于葡萄科、滕黄科、杨梅科等植物中，其中在藤茶属植物中含量最高，具有抗氧化，抗血栓，抗肿瘤，降血糖等作用[3]。研究显示，DHM可通过激活PPARγ共激活因子1α(peroxisome proliferator activated receptor-γcoactivator-1 α，PGC-1α)改善小鼠骨骼肌胰岛素的敏感性[4]，PGC-1α是白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化过程中重要的转录调控因子; Liu等[5]发现DHM可降低肥胖Zucker糖尿病大鼠体质量和肝脏及脂肪组织脂肪沉积，这些研究提示：DHM可能促进WAT棕色化抵抗高脂饮食诱导的小鼠肥胖。为此，本文通过检测DHM对肩胛下脂肪组织形态，UCP-1、PRDM16、AMPK、PGC-1α和Sirt1的mRNA以及蛋白表达水平的影响，观察DHM对肥胖小鼠肩胛下脂肪组织棕色化的影响并阐明其机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物3~4周龄C57BL/6J小鼠, ♂, 体质量(16~19) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物使用许可证号：SCXK(湘)2013-0004。小鼠在南华大学动物房(3~5只一笼)适应性喂养一周后，正式开始实验。动物房12h明暗交替; 环境温度为(23~24) ℃，湿度为0.40~0.60，实验操作遵照《国家实验动物健康与管理条例》进行。
1.2 材料二氢杨梅素(DHM)由张家界志诚生物科技有限公司提供。UCP1和Prdm16兔抗鼠多克隆抗体(Abcam公司)，PGC1α和AMPK兔抗鼠单克隆抗体(Cell Signaling公司)、β-actin和Sirt1兔抗鼠多克隆抗体(Absin公司)。UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1引物由在线软件primer5设计，上海生工生物工程有限公司合成，Pubmed验证。
1.3 仪器-80 ℃超低温冰箱(奥林巴斯生物公司); 定量PCR仪(美国BIO-TEK公司); 高速低温离心机(其林贝尔生物公司); 蛋白电泳转膜系统、电泳槽/转印槽(美国Bio-Rad公司)。
1.4 小鼠肥胖模型的建立和实验分组C57bl/6j小鼠(60只)适应性喂养1周后，分别普通饲料和高脂饲料喂养，同时用或不用低、高剂量的DHM(125 mg·kg-1·d-1、250 mg·kg-1·d-1)灌胃处理，因此，本实验共分成6小组：正常对照组(ND组)、正常对照+低剂量DHM组(ND+L-DHM组)、正常对照+高剂量DHM组(ND+H-DHM组)、高脂饮食组(HFD组)、高脂饮食+低剂量DHM组(HFD+L-DHM组)、高脂饮食+高剂量DHM组(HFD+H-DHM组)。每4周测小鼠体质量一次，16周末高脂饲料喂养的小鼠体质量为普通饲料喂养的小鼠体质量的1.2倍，认为小鼠肥胖模型成功建立。
1.5 空腹血糖和Lee’s指数16周末，小鼠禁食过夜，称重后，剪断尾尖流出尾静脉血，采用北京仪成血糖仪检测小鼠空腹血糖。接着脱颈椎处死小鼠，测量体长(从小鼠鼻尖到肛门的距离)后，根据公式计算Lee’s指数
取肩胛下脂肪组织，置于4 ℃磷酸缓冲液(0.01 mol·L-1 PBS，pH 7.3)中洗去血液，在10%甲醛溶液中固定脱水后、浸蜡、包埋、切片、苏木精染色、200倍显微镜下随机选择4个视野进行观察。
1.7 实时定量PCR检测肩胛下脂肪组织UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1的基因表达取肩胛下脂肪组织，按照说明书提取RNA、逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。UCP1正义引物：5′-CACGGGGACCTACAATGCTT-3′，反义引物：5′-ACAGTAAATGGCAGGGGACG-3′(191bp); Prdm16正义引物：5′-CACGTCTACGGTGAACGGAA-3′，反义引物：5′-ATGGGATCCATGAAGAACGGT-3′(122 bp); AMPK正义引物：5′-GATGATGACCATGTGCCAACTC-3′，反义引物：5′-TTATTGCGGCCCTCTTCATG-3′(136 bp); PGC1α正义引物：5′-TGACCACAAACGATGACCCTC-3′，反义引物：5′-GACTGCGGTTGTGTATGGGAC-3′(103 bp); Sirt1正义引物：5′-CAGCATCTTGCCTGATTTGTAA-3′，反义引物：5′-TGGGGTATAGAACTTGGAATTAGTG-3′(268 bp); GAPDH正义引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACA-3′，反义引物：5′-AGGGGGGCTAAGCAGTTGGT-3′(247 bp)。PCR反应条件为：95 ℃，5 min; 94 ℃，1 min; 58 ℃，30 s; 72 ℃，30 s(35 cycle); 72 ℃，7 min。各个基因的相对表达使用2-ΔΔCt计算。
1.8 Western blot检测肩胛下脂肪组织UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1蛋白表达提取各组小鼠肩胛下脂肪组织总蛋白，经蛋白定量后取30μg蛋白样品进行电泳, 转膜、封闭、分别加入抗UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1抗体过夜，洗涤后孵二抗，2 h后充分洗涤后，加ECL化学发光试剂，曝光后扫描，用图像分析软件进行灰度分析。
1.9 统计学处理SPSS 20.0软件进行统计分析，实验数据多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)、两两比较采用t检验，结果以x±s表示。
2 结果 2.1 二氢杨梅素对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体质量影响如Fig 1所示：高脂饲料处理c57bl/6j小鼠16周后，体质量高于正常对照小鼠，提示肥胖模型复制成功。与HFD组比较，HFD+L-DHM组和HFD+H-DHM组小鼠体质量降低，但ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM 3组小鼠体质量差异无显著性，说明DHM仅仅降低高脂饲料喂养的肥胖小鼠体质量，而对正常小鼠体质量无明显影响。
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| Fig 1 Body mass of c57bl/6j mice fed with high fat diet reduced by dihydromyricetin(x±s, n=10) *P < 0.05 vs ND group; #P < 0.05 vs HFD group. |
如Fig 2所示：与ND相比，HFD组血糖和Lee’s指数增高，无论是高剂量还是低剂量的DHM均能降低HFD的小鼠血糖和Lee’s指数。而ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM三组小鼠血糖和Lee’s指数差异无显著性。
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| 图 2 Effect of dihydromyricetin on the blood glucose and Lee’s index in obese mice induced by high fat diet(x±s, n=10) A:Blood sugar; B:Lee's index. 1: ND; 2:ND+L-DHM; 3:ND+H-DHM; 4:HFD; 5:HFD+L-DHM; 6:HFD+H-DHM; #P < 0.05 vs HFD group. |
HE染色结果显示：与ND组相比，HFD组肩胛下脂肪组织脂肪细胞的直径增加，而经DHM(125 mg·kg-1·d-1或250 mg·kg-1·d-1)处理的HFD诱导的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织脂肪细胞变小，但ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM 3组小鼠肩胛下脂肪组织脂肪细胞大小无差异。提示：DHM可限制高脂喂养的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织脂肪细胞变大。
2.4 DHM对肩胛下脂肪组织UCP1和Prdm16的基因及蛋白表达的影响为观察DHM能否促进HFD喂养的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织棕色化，我们检测了各组小鼠肩胛下脂肪组织WAT棕色化因子(UCP1和Prdm16)的基因及蛋白表达。图 4显示：与ND组比较，HFD组肩胛下脂肪组织UCP1和Prdm16的基因及蛋白表达降低，无论是高剂量还是低剂量DHM均能提高HFD小鼠UCP1和Prdm16的表达; 但DHM不影响正常小鼠UCP1和Prdm16的表达。提示：DHM可促进HFD喂养的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织棕色化。
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| Fig 3 Effect of dihydromyricetin on size of subscapular fat cells in high fat diet induced obese mice(x±s, n=4) A:Subscapular fat HE staining(20×); B:Subscapular fat cell size; 1: ND; 2:ND+L-DHM; 3:ND+H-DHM; 4:HFD; 5:HFD+L-DHM; 6:HFD+H-DHM. *P < 0.05 vs ND group; #P < 0.05 vs HFD group. |
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| Fig 4 Effect of dihydromyricetin on the mRNA and protein expression of UCP1 and Prdm16 in high fat diet induced obese mice(x±s, n=3) 1:ND; 2:HFD; 3:HFD+L-DHM; 4:HFD+H-DHM. *P < 0.05 vs ND group; #P < 0.05 vs HFD group. |
为进一步探讨DHM促进HFD喂养的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织棕色化的机制，小鼠肩胛下脂肪组织AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表达被检测。如图 5所示：与ND组比较，HFD组肩胛下脂肪组织AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表达水平下降; 与HFD组比较，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM组肩胛下脂肪组织AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表达水平升高，但DHM不影响正常小鼠AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表达。提示：DHM可能通过激活AMPK-PGC1α-Sirt1信号通路促进HFD喂养的肥胖小鼠肩胛下脂肪组织棕色化。
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| Fig 5 Effect of dihydromyricetin on the mRNA and protein expression of AMPK, PGC1α and Sirt1 in obese mice induced by high fat diet(x±s, n=3) 1:ND; 2:HFD; 3:HFD+L-DHM; 4:HFD+H-DHM. *P < 0.05 vs ND group; #P < 0.05 vs HFD group. |
据统计现今全世界肥胖及超重的人数已达21亿，接近全世界总人口的30%，而中国已成为世界的第二大“肥胖国”[6]，其肥胖人数仅次于美国[7]。因此，肥胖问题亟待解决。目前对肥胖的治疗主要是改变生活方式、药物和手术治疗[8]。改变生活方式常常由于病人无法坚持而失败[9]，手术治疗存在极大的手术风险，而药物治疗虽然在一定程度上可靠，但由于其毒副作用较大限制其使用[10]。因此，寻找安全、毒副作用少的减肥药物一直是科学家们的追求。
传统的观点认为：哺乳动物体内存在两种不同类型的脂肪组织，白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪组织。WAT能将体内的能量以脂肪形式储存起来，当能量摄入超过能量消耗时，WAT将会在体内堆积，从而引发肥胖。棕色脂肪组织内含许多线粒体，线粒体膜上存在大量解耦联蛋白UCP1，UCP1能将葡萄糖和脂肪分解[11]。因此，棕色脂肪组织可燃烧脂肪，具有减肥作用。因此，若能促进肥胖患者体内的WAT转变成棕色脂肪组织，将促进体内能量消耗，从而达到减肥的目的，这无疑给肥胖治疗带来福音。
二氢杨梅素(DHM)为藤类植物黄酮类化合物，具有多种药理学作用，大量文献表明DHM具有降糖、降脂和抗肿瘤等作用[12-13]。我们在前期预实验中发现，经DHM处理过的2型糖尿病小鼠皮下脂肪组织出现肉眼可见的棕色化改变，但DHM是否可促进WAT棕色化从而抵抗肥胖，还未见文献报道。因此，本实验通过高脂饮食喂养小鼠复制肥胖小鼠模型，观察DHM对肥胖小鼠的体质量、血糖、Lee’s指数、肩胛下脂肪细胞的形态及大小和棕色化因子UCP1, Prdm16的基因及蛋白表达的影响。结果显示：与ND组比较，HFD组小鼠体质量、血糖、Lee’s指数和肩胛下脂肪组织脂肪细胞直径明显增加，UCP1、Prdm16基因及蛋白表达明显降低; DHM可明显逆转HFD小鼠上述指标的改变，但DHM对正常小鼠无影响。提示DHM可促进肩胛下脂肪组织棕色化，抵抗高脂饮食诱导的肥胖。那么，DHM促进肩胛下脂肪组织棕色化的机制是什么呢？
长期以来，人体内的棕色脂肪被认为仅存在于婴幼儿时期。近年的研究显示，成人体内亦有少量棕色脂肪存在。人体内的棕色脂肪主要分布于肩胛间、腋窝下、肾周及脊柱旁。因此，本文选择肩胛下的脂肪组织作为研究对象。另有研究显示，“WAT棕色化”有关的作用靶点是PGC1α，AMPK是PGC1α的重要调节因子[2]。又有文献报道：DHM可经AMPK-PGC1α-Sirt1信号通路提高小鼠骨骼肌胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗[4]。提示：DHM可能通过AMPK-PGC1α-Sirt1信号通路来促进肩胛下脂肪组织棕色化抵抗高脂饮食诱导的肥胖。因此，我们通过实时定量PCR和WB检测了各实验组小鼠肩胛下脂肪组织中AMPK、PGC1α和Sirt1mRNA和蛋白表达，结果显示：HFD组中AMPK、PGC1α和Sirt1mRNA和蛋白表达水平低于ND组，但DHM对正常小鼠这些基因及蛋白表达无影响。
综上所述，我们推测DHM可通过AMPK-PGC1α-Sirt1信号通路促进肩胛下脂肪组织棕色化抵抗高脂饮食诱导的肥胖，为DHM减肥提供了新的途径和策略，为肥胖相关的代谢综合征也带来新的治疗方案。
( 致谢: 本实验在南华大学神经生理研究所以及南华大学实验动物中心完成，衷心感谢各位老师的支持与帮助。)
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