2. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室, 甘肃 兰州 730000;
3. 甘肃中医药大学中西医结合研究所，甘肃 兰州 730000;
4. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000
2. Provincial Key Lab of Molecular Medicine and Prevention and Treatment of Major Diseases with Traditional Chinese Medicine in Gansu Colleges and Universities, Lanzhou 730000, China;
3. Institute of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;
4. Gansu Provincial Lab of Chinese Medicine Pharmacology and Toxicology, Lanzhou 730000, China
近年来研究提示，细胞存活能力基于消除压力条件的能力，此种过程涉及自噬和细胞凋亡的调节及相互整合[1]。肿瘤细胞可通过自噬作用抵抗由于过度增殖造成的营养缺乏和缺氧，以维持生存[2]。黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是黄芪(astragalus membranaceus，AM)干燥根主要的活性成分之一，在肺癌的治疗中应用广泛[3]。自噬与肺癌发生和治疗的关系是近年来的研究热点，因此，本实验采用20 U·L-1黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)作用于人肺癌A549细胞24 h诱导自噬发生[4]，前期预实验利用透射电镜与Western blot验证自噬模型，结果提示XOD可成功诱导人肺癌A549细胞发生自噬；模型成功后通过药物干预，观察并检测APS对人肺癌A549细胞自噬模型增殖、自噬小体形态及自噬相关分子表达的影响。
1 材料 1.1 细胞株人肺癌A549细胞株购买于中国科学院上海细胞库，保存于甘肃中医药大学科研实验中心超低温冰箱。
1.2 试剂黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，购自Sigma公司；APS(纯度>90%)，购自中国上海源叶生物科技公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(纯度>99%)，购自APExBIO公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，购自中国杭州四季青公司；DMEM高糖培养基，购自Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、青霉素链霉素混合液，购自gibco公司；Gluta固定液(电镜专用，2.5%)，购自Solarbio公司；细胞计数(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒，购自中国上海翊圣公司；蛋白提取试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒，均购自Solarbio公司；微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha，LC3A/B)抗体、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、抗体死骨片1(Seques-tosome 1，SQSTM1/p62)抗体、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinosi-tide 3-kinase，PI3K)多克隆抗体，均购自Gene Tex公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体，购自Immunoway公司；山羊抗兔IgG二抗，购自Abcam公司。
1.3 仪器超净工作台(苏洁净化公司，SW-CJ-1D)；二氧化碳培养箱(日本三洋电机公司，MCO-18AIC)；酶标仪(美国BIO-RAD公司，IMARK)；全自动细胞荧光计数分析仪(美国CELLOM ETER公司，AUTO X4)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司，IX81)；凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司，Chemi Doc)；-80 ℃超低温冰箱(Thermo公司，900 SERIES)；透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM，日本电子株式会社，JEM-2100F)。
2 方法 2.1 A549细胞培养取肺癌A549细胞株1支，移至37 ℃恒温水浴锅中迅速解冻复苏，移液枪移至5 mL培养体系的培养瓶中，将提前配好的完全培养基加至5 mL，并加入50 μL青霉素链霉素混合液，置于5% CO2、37 ℃饱和湿度孵箱中培养，于次日PBS轻柔洗涤并换液1次，待细胞完全贴壁后可2~3 d换液1次，融合度达80%后，0.25%胰蛋白酶1 mL进行消化传代，取第3代细胞用于实验。
2.2 肺癌A549细胞自噬模型的建立及分组实验采用5 mL培养体系培养瓶进行细胞培养，分为空白组、模型组、(100、200、400) mg·L-1APS处理组、2 mmol·L-1 3-MA处理组，每组设3个平行样本。给药干预前，除空白组外，其余5组使用20 U·L-1XOD干预24h，建立自噬模型，前期预实验观察自噬体形态和检测自噬标志蛋白LC3B、p62水平，结果提示XOD可成功诱导肺癌A549细胞发生自噬。按照实验分组，造模成功后，模型组给予完全培养基培养24 h，其余4组分别加入相应浓度的药物处理24h。采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态，收集细胞进行指标的检测。
2.3 CCK-8检测各组细胞生长曲线收集对数期各组细胞，移液枪吹打均匀制成细胞悬液，调节细胞浓度至2×107·L-1，将其接种于96孔板，每孔接种100 μL细胞悬液，设6个复孔，在接种有细胞孔的外围加入100 μL PBS以排除干扰；待测前1~2 h加入10 μL CCK-8溶液，于酶标仪分别检测接种后第6、12、24、48、72 h 450 nm波长处的OD值，每组检测3次。
2.4 透射电镜观察自噬小体的形态各处理组A549细胞培养48小时后，PBS冲洗3次，胰蛋白酶消化细胞1 min左右，倒置显微镜下观察细胞变圆、变亮及间隙增大，立即加入500 μL完全培养基终止消化，轻轻吹打直至细胞全部脱落，将细胞悬液移至1.5 mL子弹头离心管封口离心，细胞离心至管底，吸出废液，加入1 mL PBS连续离心2次，管底细胞团至米粒样大小，弃掉上清，加入200 μL体积分数为0.025的戊二醛，4 ℃冰箱过夜固定细胞，PBS洗涤3次，用4 ℃预冷的体积分数为0.01锇酸固定2 h，PBS洗涤3次，体积分数为0.5、0.7、0.8、0.9、1乙醇及体积分数为1的丙酮梯度脱水，环氧树脂浸透、包埋，超薄切片机切片，厚约50~70 nm，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，制片成功后，透射电镜观察并拍照。
2.5 Western blot检测肺癌A549细胞LC3B、p62、PI3K、AKT等蛋白的表达收集各组细胞，提取细胞蛋白并定量。各组样品恢复至室温后上样，经0.05、0.12 SDS-PAGE分离，转膜，封闭后，分别与一抗LC3A/B(1 :150)、p62(1 :1 000)、PI3K(1 :1 000)、AKT(1 :1 000)及GAPDH(1 :5 000)蛋白相结合，室温摇床过夜；次日PBST侵洗后分别与山羊抗IgG二抗(1 :5 000)结合，室温轻摇1 h；HRP-ECL发光显色后，凝胶成像系统曝光检测。采用Quantity One 4.6.2软件对图像进行灰度值分析，以GAPDH作内参，蛋白相对表达量为目的蛋白条带与内参GAPDH条带的比值，每组测3组数据。
2.6 统计学分析计量资料以x±s表示。实验数据的统计采用SPSS22.0统计软件，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较，组间差异采用q检验。
3 结果 3.1 黄芪多糖对肺癌A549细胞增殖活力的影响如Fig 1所示，与空白组比较，模型组、APS (200、400) mg·L-1干预组及3-MA组在第12~48 h，细胞活力显著性降低，100 mg·L-1APS干预组在第12~48 h，细胞活力增强(P＜0.05)；与模型组比较，APS (200、400) mg·L-1干预组与3-MA组在第12~48h，细胞活力降低(P＜0.05)；与3-MA比较，APS (200、400) mg·L-1干预组对肺癌A549细胞活力抑制能力更接近；且APS各干预组在第24 h出现作用峰值。
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| Fig 1 Effect of APS on proliferation of A549 cells in a XOD-induced autophagy model (x±s, n=6) |
如Fig 2、3所示。TEM结果提示，空白组肺癌A549细胞内可观察到线粒体、内质网基本形态及脂肪滴。与空白组比较，经XOD处理后的模型组，细胞内可见双层膜自噬小体、脂滴及自噬泡，LC3B蛋白表达显著性增高，p62蛋白表达降低(P＜0.05)。与模型组比较，100 mg·L-1APS干预组细胞内仍可见双层膜自噬小体及其吞噬的内容物，LC3B蛋白表达显著性降低，p62蛋白表达增高(P＜0.05)；与模型组比较，APS (200、400)mg·L-1干预组细胞内几乎观察不到自噬小体，3-MA组细胞内偶见自噬小体，LC3B蛋白表达显著性降低，p62蛋白表达增高(P＜0.05)。
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| Fig 2 Ultrastructure of autophagosomes in A549 cells of each group(×25 000, bar=0.5 μm) A:Control group; B:Model group; C:100 mg·L-1 of APS-treated group; D:200 mg·L-1 of APS-treated group; E:400 mg·L-1 of APS-treated group; F:2 mmol·L-1 of 3-MA treated group. |
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| Fig 3 Expression of autophagy markers LC3A/B, p62, AKT and PI3Kin each group(x±s, n=6) A:Control group; B:Model group; C:100 mg·L-1 of APS-treated group; D:200 mg·L-1 of APS-treated group; E:400 mg·L-1 of APS-treated group; F:2 mmol·L-1 of 3-MAtreated group. *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs model group; #P < 0.05 vs 3-MA-treated group. |
如Fig 3所示。与空白组比较，模型组LC3B及PI3K蛋白表达增高，p62及AKT降低(P＜0.05)。与模型组比较，200、400 mg·L-1APS组及3-MA组LC3B、PI3K蛋白表达下降，p62及AKT蛋白增高(P＜0.05)。与3-MA组比较，200 mg·L-1APS组LC3B蛋白表达下降，400 mg·L-1APS组PI3K蛋白下降(P＜0.05)。
4 讨论真核生物在进化过程中，保留自噬用于细胞内物质的更新，特别是PI3K/AKT信号通路与大多数生理过程相关，包括细胞代谢、增殖等。在肿瘤中，自噬对细胞具有保护和细胞毒性双重作用，一方面通过自噬作用维持基因组完整性和防止肿瘤细胞增殖，与免疫监视作用相结合防止肿瘤发生；另一方面在已发生的实体瘤中，肿瘤细胞外环境缺氧和营养缺乏影响其自身生存，迫于生存压力，肿瘤细胞可利用自噬机制，获得继续生长的能量及增殖的空间[5]。因此，利用某种药物抑制此过程中的自噬作用，可起到抗肿瘤目的。
自噬是一种细胞内溶酶体参与分解未折叠蛋白或处理变异蛋白、降解胞内受损的细胞器、外源微生物的自我保护机制，形态学上以形成自噬体为特征。LC3定位于自噬泡的内层膜，其表达产物LC3A随着自噬过程被启动，与磷脂酰乙醇胺结合形成膜型LC3B，其含量与自噬发生程度正相关，间接反映自噬体数量，被认为是判定自噬活性的特异性灵敏标志分子[6]。相反当自噬抑制后，p62蛋白开始累积，而当自噬诱导时，p62水平下降，但LC3B的增加与p62的下降并无明显相关[7]。因此，可采用自噬标志性蛋白LC3B与p62及透射电镜观察自噬小体典型形态学特征(即大量双层膜结构)共同监测自噬反应[8-9]。
李蓉[10]、廖双叶[11]研究发现，黄芪多糖可抑制人肺癌A549细胞增殖及促进细胞凋亡。本课题组前期研究也发现[12]，APS及联合化疗药物顺铂(cis-diamm inodichloroplatinum Ⅱdichloride，DDP)可能通过调节线粒体凋亡途径相关蛋白抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长。细胞凋亡(Ⅰ型细胞程序性死亡)和细胞自噬(Ⅱ型程序性死亡)是细胞程序性死亡的两种主要表现。因此，本研究在前人实验基础上，寻求APS对肺癌A549细胞自噬的影响及其分子机制。实验结果发现，200、400 mg·L-1APS组及自噬抑制剂3-MA组细胞内自噬反应明显减弱，同时细胞活性降低，与蒲泽锦等[13]研究结果一致。TEM结果提示：与空白组比较，经XOD处理24 h后的模型组，细胞可见双层膜自噬小体、脂滴及自噬泡，LC3B蛋白表达增高，p62及AKT显著性降低，PI3K蛋白升高，TEM与Western blot结果共同确定模型组发生较高水平的自噬(P＜0.05)；与模型组比较，200、400 mg·L-1APS干预组细胞内几乎观察不到自噬小体，LC3B蛋白表达降低，p62及AKT蛋白增高，PI3K蛋白下降，且细胞活性降低(P＜0.05)，TEM与Western blot共同提示200、400 mg·L-1APS可降低A549细胞自噬水平；与3-MA组比较，200 mg·L-1APS组LC3B蛋白表达下降，400 mg·L-1APS浓度组PI3K蛋白下降(P＜0.05)，这表明APS对PI3K蛋白表达的抑制优于3-MA。上述结果表明APS可抑制肺癌A549细胞的自噬程度，可能与调节LC3B、PI3K及AKT蛋白表达有关，使用PI3K抑制剂3-MA可以阻断LC3的表达，APS具有相同趋势[14]。通过降低PI3K蛋白表达阻断自噬泡和溶酶体的融合，降低LC3B蛋白表达而抑制自噬小体双层膜的形成，从而抑制自噬程度[15]。APS可增高AKT蛋白的表达，可能与PI3K蛋白表达降低致使其对下游分子AKT蛋白的活化作用减弱有关，使得AKT积累。综上所述。APS可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥自噬抑制作用。因此，我们推测APS能通过自噬抑制作用，使A549细胞面临快速增殖带来的缺氧和营养缺乏等困境，进而抑制肿瘤细胞的生长。综上所述，本研究发现，APS可能通过抑制肺癌A549细胞自噬而发挥抗肿瘤作用。
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