中性粒细胞受到多种刺激因子如白细胞介素-8、脂多糖^[1]、镍及致病菌等刺激后，通过吞噬、脱颗粒、活性氧爆发等一系列过程会产生DNA-蛋白质网状结构参与清除病原体。这种由中性粒细胞产生的复杂网状结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs一方面在病灶部位募集相关蛋白酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophilelastase，NE)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)等包裹病原体；另一方面通过激活多种调节信号阻断外来致病菌的扩散和转移。网状结构最后由巨噬细胞吞噬代谢，未被吞噬的可以在核膜酸酶的作用下快速降解完成免疫反应^[2]。但是，术后NETs扩散可能导致结肠癌的复发和凝血系统的紊乱^[3]，逃逸降解的NETs积聚还会引发机体的排斥反应。因此，NETs作为机体多种免疫炎性疾病、血栓、癌症等病理生理过程的重要参与者和标志物，检测其浓度具有重要临床意义。本文从成网标记物着手，对应用现有技术测定循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)和酶蛋白类(NE、MPO)浓度来量化NETs的方法进行系统综述(Tab 1)，为后续研究提供参考。

1 cfDNA/ NETs检测法

cfDNA是双链和高度碎裂的DNA，90%存在有低分子量带(150~180 bp)。Volckmar等^[4]根据10 μL血浆中的DNA就能检测到胎儿Y染色体序列证实临床上整个病原体的刺激比实验中单一因素刺激产生更多的cfDNA。cfDNA和组蛋白作为NETs的关键组成部分，能激活免疫应答帮助宿主对抗感染性和非感染性炎症^[5]。然而，它们也可能通过触发凝血、炎症、细胞死亡和损害纤溶而引发副作用^[6]。所以，cfDNA/NETs是评价机体感染程度的新指标。除此之外，样品中双链DNA(dsDNA)的数量也可以间接表示NETs的量^[7]。虽然不能排除其他形式细胞死亡产生dsDNA的干扰，但是，实验血清中其他方式产生的dsDNA量与网捕死亡产生的量相比所占比例较低，该方法依然有效。

1.1 荧光染色法

根据特定波长下荧光强度与DNA含量呈正相关的原理，人们通过荧光酶标仪检测荧光染料与DNA特异性结合的荧光强度，来反映DNA数量的方法统称为荧光染色法。继2004年Brinkmann等^[8]在荧光染色细胞上清液中的cfDNA，首次揭示了NETs是中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种网状结构，奠定了染色法在NETs检测中的重要地位。2008年Margraf等^[9]选择绿色荧光染料(Picogreen，分子探针)作为DNA结合物，在485nm波长处的发射荧光下快速检测cfDNA，证明cfDNA/ NETs可诊断或预测创伤后并发症。部分国内学者采用Picogreen荧光染色结合Pearson或Spearman相关性分析和t检验数据共同分析血清中dsDNA含量，提高数据可靠性。此外，后续实验中多用Sytox green染色后，在激发光485 nm，发射光535 nm条件下立即读取荧光数，以减少由于时间过长造成DNA样品反应过度的可能，使量化结果更准确^[10]。荧光染色法操作方便适用范围广，但是cfDNA分子量小，杂质标记物的筛选困难，设置相应的阴性对照排除非特异性结合的杂质是实验不可或缺的一部分。

1.2 免疫组化和共聚焦显微镜法

在免疫组化过程中，显色剂标记特异抗体，激光共聚焦显微镜跟踪扫描活细胞组织或切片，可得到NETs不同层面的高分辨率光切图像。在细胞骨架、细胞膜、细胞器、染色体的三维成像方面表现突出。Chatfield等^[11]模拟人痛风性关节炎患者滑液中NETs状态并标记DNA，发现MSU诱导的中性粒细胞“自杀”性死亡形式-NETosis不同于佛波酯(PMA)或念珠菌诱导的NETosis和其他形式的细胞死亡(包括坏死性凋亡)。与荧光仪检测相比，免疫组化和激光共聚焦法能捕捉到更精细的网状结构。Shimomura等^[12]用经典的DAPI染色DNA，分析共聚焦显微镜下DNA图像灰度评估NETs形成状况，计算NETs和总嗜中性粒细胞数量，并由此发现2 mg·L^-1的重组人可溶性血栓调节蛋白足以阻断LPS和活化的血小板与中性粒细胞相互作用形成NETs。该实验优点是三维电镜技术的参与扩展了镜检的横向维度和清晰度，轻松实现组化染色后NETs图像筛选。缺点是操作步骤繁琐，仅能检测已知特异性抗体的组织结构，且洗涤过程易洗掉NETs，需结合单因素或双因素方差分析法增加可行性^[13]。另外，人工处理核边界部分时，容易受到主观臆测的干扰。这和Hamilton等早期报道的所有定量方法无论以何种形式，都有各自的局限性观点相一致。

2 蛋白酶/NETs检测法

NE和MPO位于中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒上，能裂解组蛋白，参与染色质的去致密化过程，该过程是NETs形成初期的重要环节。在脓毒症^[14]和冠心病^[15]等慢性炎症患者的长期监测过程中，炎症患者体内MPO和NE都会有不同程度的升高。而抑制HMG-CoA还原酶活性的他汀类降脂药可减少NE释放，调节炎症转归过程。因此，定量检测蛋白酶类炎性标志物是有效判断NETs的形成状态的新一轮研究方向。

2.1 中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的检测 2.1.1 蛋白质印迹法

该法是继DNA印迹和RNA印迹之后发展起来的一种新的蛋白检测技术，主要过程包括电泳、转膜和免疫性标记。根据NE由267个氨基酸组成，分子质量为28~31 ku，蒋静等采用60 V恒压电泳，转膜后5%脱脂奶粉封闭，再孵育、洗膜的方法得到NE蛋白表达结果。与ELISA测定的NE含量作对照，表示肝素可下调脓毒症患者病变部位NETs水平，起到保护机体的作用。Papayannopoulos等^[16]分析印迹结果显示NETs组分纯度，确定了NE可促进染色质浓缩的新机制。除此之外，Shapiro等^[17]还发现NETs对大多数细胞外基质底物具有强催化活性，而缺乏NE时，小鼠对香烟烟雾表现出一定的抗性。免疫印迹法优点是可以从蛋白表达方面解析NE的定性和半定量问题。缺点是费时，变量多，蛋白样品的制备直接决定整个实验的成功与否，如：①蛋白酶样品处理不当导致直接降解或表达；②裂解液、缓冲液和蛋白酶抑制剂配比错误；③蛋白浓度测定试剂盒选择错误或标准曲线测定不准确。

2.1.2 微孔板显色法

该法以微孔为载体，基于样品与底物的特异性反应，借助微孔板检测仪反映样品浓度。常用Alamar blue和特定氨基酸底物作底物筛选抗菌药抑制剂和微量蛋白，具有快速灵敏的特点。微孔板根据用途分为酶标板、细胞培养板和高通量筛选板。Mitroulis等^[18]从急性痛风期患者滑膜液提取的中性粒细胞六孔板培养，捕捉每孔NETs的荧光图像，相当于同时获得多个独立的实验结果，便于比较分析。另外，早在1974年就有学者发现NE对有机溶剂的敏感性较高，所以Kunder等延用前人方法，以琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-丙氨酰-对硝基苯胺作为反应底物进行显色试验。近期，Karandashova等^[19]根据NE发挥催化作用中心之一的Ser残基上连有羟基，易与Ala(丙氨酸)、Met(蛋氨酸)、Leu(亮氨酸)、Val(缬氨酸)等不带电的小分子氨基酸结合的特点，改用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺作为底物进行微量滴定板滴定，更准确的确定了NE浓度，并证明其变化与总鞘脂、神经酰胺含量呈线性相关。总的来说，微孔板显色试验将微量蛋白的特异性反应和快速检测手段相结合，具有样品用量少，平行度和稳定度高的特点。不足之处是样本量过少时，受单个数值影响明显。

2.2 髓过氧化物酶(MPO)的检测 2.2.1 酶联免疫吸附法

临床上常应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测外周血清中抗体、抗原、激素和微生物等表达情况。Metzler等^[20]用PMA处理中性粒细胞，分时间段裂解后离心获得含可溶性蛋白的胞质溶胶。首先，ELISA监测NE 120 min后，NE会从胞质溶胶移位到细胞核。其次，在免疫组化的基础上，选用胶体金作为示踪剂标记MPO和NE，透射显微镜检查，通过电子显微照片，在细胞膜和腔中完成MPO和NE的定位。此处ELISA结合免疫组化虽然提高了MPO选择性和敏感性，但是不构成蛋白质结合度和密度的定量评估。Nizam等^[21]对牙周炎患者组和健康人群组的唾液、MPO、NE血清浓度进行ELISA测定，确定全身性慢性牙周炎的生化数据。考虑到临床收集的中性粒细胞存在多重结构状态，取样也具有随机性，更多研究者体外刺激中性粒细胞形成NETs。此外，抗原抗体结合的环境不适会增加背景，影响结果判定^[22]。因此，Franck等以新鲜马血为研究对象，稀释血清减少MPO和样品环境中其它生物分子之间的相互作用，同时改良MPO和初级抗体之间的结合方式，实现了MPO浓度测定的初衷。除了重复性差，该方法灵敏、快速且成本低可实现自动化，成为检测早期免疫炎性疾病病情及预后效果中重要指标NETs的优先方案。

2.2.2 流式细胞法

流式细胞术(flow cytometry)标记样品液相通过流式细胞仪，可高速分选亚细胞及细胞内颗粒物(DNA、RNA及蛋白质等)。Bekeschus等^[23]流式细胞仪的阳性染色结果证实，MPO存在于伤口处的中性粒细胞内，而伤口溶液中存在NETs。Gavillet等^[24]同时检测MPO和组蛋白，确定血液样品中的NETs状态。Masuda等^[25]则重点关注MPO和来源于NETs的DNA共定位研究。尽管蛋白质印迹法和ELISA是目前实验室最常用的检测方法，但是大多数ELISA方法对样品依赖性强(例如：孵育时间，移液失误)，通常不是自动化，与本法相比，需要更长的测定时间。流式细胞术略去洗涤步骤，大大提高了酶蛋白灵敏度^[26]。然而，流式细胞术应用于蛋白有一定的局限性，如：一般检测的是细胞质内的MPO，给NETs定量造成一定误差。

2.2.3 荧光免疫层析法

该法原理与ELISA相似，两种试验方法都是依赖于标记的抗体特异性检测抗原，可实现待测样品的定性和定量。王云龙等利用EDC(可溶于水的碳二亚胺)活化的羧基荧光微球与MPO抗体偶联形成标记复合物，保护基质在不受荧光物质影响下定量检测MPO，为冠心病的临床快检提供了新思路。Funchal等^[27]检测到NETs能由真菌、细菌和病毒诱导产生，特别是呼吸道合胞体病毒的F蛋白，而其结构中的蛋白质(NE、MPO)来自嗜天青颗粒。荧光免疫层析法的优点是荧光标记物的信号强度和激光强度呈正相关，降低层析技术的检测限，满足快检的要求。但该法对化学成分的抗干扰能力差，限制了其在蛋白定量中的应用。

3 其他组分的检测NETs法

血清中炎症因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、H3Cit(瓜氨酸化的H3组蛋白)^[28]可加速NETs网状结构的生成。比较患者组和对照组炎性因子的差异，分析IL、TNF和NETs成分NE、MPO相关性，是另一个决定初期中性粒细胞网状结构的标志，然而，除了NETs，粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞也会刺激机体产生大量炎性因子，所以利用该法对NETs定量的准确率不高，建议只作为一种参照。

4 展望

已知NETs在糖尿病、系统性红斑狼疮和小血管炎、类风湿关节炎等炎性疾病中发挥局部免疫作用^[29]。但是，目前定量体内NETs的研究尚处于初级阶段。近年来，检测NETs大多以简单荧光标记染色法为主，测定范围广、操作简单、但是标记物筛选存在相当大误差。随着显微镜技术和数字分析技术的发展，综合使用精密仪器可提高定量目标NETs的成功率，然而，大型仪器成本高，且不能实现体内cfDNA、NE、MPO浓度的自动化测定^[30]。为了克服这些检测手段的局限性，有必要发展新的低成本高准确性的自动化检测手段，简单快速确定NETs的浓度，为临床患者提供新的诊疗依据，以期改善慢性炎症及癌症的治疗现状。