2. 浙江大学明州医院药剂科，浙江 宁波 315000;
3. 温州医科大学药学院，浙江 温州 325000
2. Dept of Pharmacy, Zhejiang University Mingzhou Hospital, Ningbo, Zhejiang 315000, China;
3. Pharmaceutical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是神经系统最严重创伤之一。目前，已有很多促进受损脊髓的修复策略，其中损伤处神经的再生与修复尤为重要[1]。脊髓在损伤后具备轴突再生潜力，而损伤的轴突能否再生与其内在因素和局部微环境均有关[2]。研究表明，多酚类化合物阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)，可改善SCI引起的运动功能障碍[3]，且其机制涉及神经保护与神经再生作用。但SF需长期大剂量给药才能达到疗效，原因在于口服给药不易透过血-脊髓屏障，导致其在应用时出现瓶颈。近年来，人工合成高分子支架材料是目前治疗SCI的研究热点之一。
本实验通过建立SCI动物模型，以原位注射方式进行分组给药。通过观察各组大鼠的运动能力变化，比较SF溶液与SF肝素-泊洛沙姆(heparin-poloxamer hydrogels，HP)水凝胶制剂的疗效，深入研究神经修复相关蛋白(GAP43、GFAP、Nestin)的表达，进一步探讨SF作用机制。通过生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine，BDA)示踪法，论证SF-HP水凝胶制剂的疗效。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♂成年SD大鼠，体质量(200±20)g，购于温州医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(浙)2015-0001。动物自由进食、饮水。本实验涉及的动物实验符合1986年欧洲共同体理事会指导，并通过温州医科大学动物护理和使用委员会批准。
1.1.2 试剂SF购于Sigma；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(sc-33673)、生长相关蛋白(growth associated protein-43，GAP43)抗体(sc-33705)、Nestin抗体(sc-23927)，购于Santa Cruz；BCA试剂盒(P0012)，购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.1.3 仪器Avanti-20XP型离心机(Beckman-Coulter)；IX70型倒置显微镜(日本Olympus)；WDT-V型脑立体定向仪(西安西北光电医疗器械厂)；电泳与转膜设备、酶标仪(Bio-Rad)；GL-20C高速离心机(Thermo)；BMJ-Ⅲ型组织包埋机(常州中威电子仪器有限公司)；石蜡切片机(英国珊顿公司)；黏度计DV-I Prime(BROOKFIELD)。
1.2 方法 1.2.1 SF-HP温敏性水凝胶的制备以夹心冷法制备SF-HP温敏性水凝胶。称取一定量的HP于西林瓶，加入含SF适宜浓度的去离子水，置4℃冰箱中过夜，使其充分吸水溶胀溶解，得到分散均匀、清澈澄明的SF-HP水凝胶溶液。
1.2.2 水凝胶胶凝温度的测定采用搅拌法检测凝胶胶凝温度。西林瓶中放置不同浓度的HP，同时加搅拌子和精密温度计，置于磁力搅拌器水浴加热，转速：100 r·min-1，保持水溶液持续缓慢升温。当其完全停止转动时，温度计显示的温度设定为胶凝温度，每一样品平行测定3次，结果取平均值。
1.2.3 SF-HP水凝胶相转变过程将1 mL的SF-HP溶液置于流变仪中，其胶凝温度为(38~40) ℃，频率设定为1 Hz，应变为0.05%，升温范围为(10~60) ℃，速率设为1 ℃·min-1。观察凝胶弹性模量和黏性模量，将两个模量相等时的温度视为相转变温度[6]。
1.2.4 SF-HP温敏性水凝胶扫描电镜用液氮处理水凝胶样品至固态，冷冻干燥48 h后喷金，然后在扫描电镜下观察水凝胶的形态[4]。
1.2.5 实验设计将大鼠随机分为假手术组、模型组、空白HP水凝胶组、SF溶液组、SF-HP水凝胶组，每组10只。在SCI手术后，SF溶液组经原位注射方式给予SF(100 mg·kg-1)，SF-HP水凝胶组给予包载等量SF的水凝胶，空白水凝胶组给予HP水凝胶。依据相关研究，SF改善脊髓损伤的有效量为100 mg·kg-1，大鼠体质量参照200 g，推算出给药量为20 mg。大鼠在手术后1、3、7、14 d进行运动评分(Basso-Beattie-Bresnahan，BBB scale)和斜板实验的行为学测试；d 14处死动物。
1.2.6 大鼠脊髓损伤模型的建立[5]方法：注射戊巴比妥钠30 mg·kg-1将SD大鼠麻醉，取俯卧位。暴露位于第8~9胸椎(T8~T9)和第9~10胸椎(T9~10)，在T9节段进行椎板切除术打开椎管。采用血管动脉夹(30 g)夹闭脊髓2 min后将动脉夹取下，缝合肌层与皮肤，至动物完全苏醒。
1.2.7 BBB评分和斜板功能评分测试运动能力[6]BBB评分：大鼠置于空旷场地，两个观察者对侧站立观察大鼠臀、膝、裸关节，行走，躯干运动及协调情况。观察时间：5 min，期间观察者按评分标准(0~21分)进行评分。
斜板功能评分：将大鼠置于Rivlin斜板上，从水平0°角位置开始，逐渐增大角度，在板上停留5s且不落下的最大角度视为评分结果。
1.2.8 HE染色乙醇梯度脱水后包埋切片，厚度4 μm。(63~65) ℃下烘片3~4 h，切片脱蜡水化，进行苏木精染色7 min。水洗后，乙醇分化5 s，伊红染色2 min，乙醇脱水，二甲苯透明后封片。
1.2.9 BDA顺行神经示踪[7]术后14 d，戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠固定于脑立体定位仪，切开头皮，确认矢状缝和冠状缝，用微型钻在以下8个点的位置钻孔，第1~2个点在前囟前方2.7 mm，颅中缝左右2.5 mm；第3~4个点在前囟前方1 mm，颅中缝左右2.5 mm；第5~6个点在前囟后方0.4 mm，颅中缝左右1.5 mm；第7~8个点在前囟后方1.8 mm，颅中缝左右1.2 mm。钻孔后，将10%浓度的BDA溶液注射入表面以下1、1.5、2.0 mm的深度，每个深度注射量为1.0 μL，注射时长2~3 min，留针5 min。2周后，取大鼠腰椎(L2)段处进行冰冻切片。最后用荧光显微镜观察BDA标记的脊髓轴突再生情况，统计阳性细胞数。
1.2.10 免疫组化检测GAP43、Nestin、GFAP表达切片脱蜡脱水后，室温静置10 min；PBS洗涤后，置于枸橼酸缓冲盐溶液中，加热至沸腾，放置5 min，PBS洗涤，加入BSA封闭液封闭20 min；吸去封闭液，PBS洗涤，加入一抗，常温孵育2 h，PBS洗涤，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，进行DAB显色液30 s，洗涤后苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化3 s，冲洗返蓝10 s，最终脱水、透明、封片。
1.2.11 Western blot检测GAP43、Nestin、GFAP表达组织样本中加入300 μL的细胞裂解液，匀浆离心取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。电泳及转膜后，封闭液封闭1 h，4 ℃孵育一抗12 h，TBST洗涤，二抗孵育1 h，洗涤后行曝光显影，用薄层扫描分析仪分析结果。
1.2.12 统计学分析采用SPSS16.0统计软件统计分析结果，结果以x±s表示，采用单因素方差分析，数据之间的比较采用Duncan检验。
2 结果 2.1 SF-HP水凝胶的制备与评价 2.1.1 SF-HP水凝胶胶凝温度的测定SF-HP温控型水凝胶制备过程中，HP浓度与胶凝温度的变化关系如Fig 1A所示。HP浓度为17%时，SF-HP温控型水凝胶的胶凝温度在37 ℃，符合温敏要求。
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| Fig 1 Characteristic of SF-HP hydrogels A: Gelation temperature of HP hydrogels; B: Viscous modulus and elastic modulus of the HP hydrogels in PBS; C: SEM images of the surface morphology of the lyophilized SF-HP hydrogels; (a):×1 000;(b):×4 500. |
温敏型水凝胶具有黏性液体和弹性固体的双重特点，分别用弹性模量和黏性模量来衡量。如Fig 1B所示，17% SF-HP水凝胶在37 ℃时弹性模量与黏性模量相等，即显示固体和液体形式量相等，为温敏性水凝胶温度达到相转变温度时的特征。当温度上升值超过相转变温度点时，再升高温度，SF-HP水凝胶中弹性模量将发挥主要作用，溶液逐渐变凝胶。其弹性模量可达近10 kPa，说明制得的水凝胶已具理想力学强度。
2.1.3 SF-HP水凝胶扫描电镜结果SF-HP水凝胶样品在扫描电镜下(Fig 1C)，呈多孔三维网络状立体结构，且孔径大小较均匀。
2.2 SF-HP水凝胶对脊髓损伤后行为学的影响假手术组脊神经功能正常，BBB评分为21分。脊髓损伤后，各组BBB评分均稳定在0~1分间，说明动物模型成功建造，损伤较一致。SF给药14 d后，治疗组评分明显高于SCI模型组(P < 0.05)，SF-HP水凝胶给药14 d后，与SF溶液组相比，评分升高更明显(P < 0.05)。斜板评分实验的结果与BBB评分结果一致，给药14 d后，SF治疗组所测得的斜板角度与SCI组相比，明显增加(P < 0.05)；SF-HP水凝胶组评分与SF溶液组相比，明显增加(P < 0.05)。见Fig 2。
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| Fig 2 Motor function changes and improvement by SF-HP hydrogel treatment(x±s, n=10) A:BBB locomotion assessment on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI; B: The inclined plane test scores on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI.*P < 0.05, **P < 0.01 vs SCI group; #P < 0.05 vs SF group. |
Fig 3A为假手术组大鼠T8~T10段脊髓的HE染色镜下的结果，脊髓组织结构正常，白质中神经纤维走向平行一致，且具一定的连续性；灰质中，神经元形态良好、分布均匀。Fig 3B显示了造模后14 d，模型组大鼠受损脊髓内部出血，结构紊乱，出现组织水肿。HP处理组脊髓损伤程度与模型组相似，表明HP单独给药无明显疗效(Fig 3C)。在给予SF溶液14 d后，脊髓灰质神经元略有增加，白质中的神经纤维排列具有一定的方向性，但排列仍然紊乱，但灰质中神经元数量不多(Fig 3D)；相比于SF溶液组，给予SF-HP水凝胶14 d后，脊髓修复状态良好，灰质白质界限较为清晰，神经细胞明显增多，神经纤维排列整齐，空洞状有明显改善(Fig 3E)。
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| Fig 3 HE staining(40× and 200×) 14 days after SCI |
如Fig 4所示，BDA神经示踪后，经过免疫荧光染色，脊髓中阳性的神经元有绿色荧光。假手术组正常功能的脊髓具有明显的绿色荧光；模型组不显示荧光，BDA阳性细胞数与假手术组相比明显减少(P < 0.01)；与模型组相比，SF治疗组出现绿色荧光，BDA阳性细胞数增加(P < 0.05)；与SF溶液组相比，SF-HP水凝胶组的BDA阳性细胞数更多(P < 0.05)。
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| Fig 4 Results of BDA 14 days after SCI(400×) A: Image of fluorescence in five groups. B: The quantitative results of BDA positive cell(x±s, n=5).**P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs SCI group; △P < 0.05 vs SF group. |
为深入研究SF-HP对脊髓损伤修复作用的机制，本实验通过免疫组化检测了GAP43、Nestin、GFAP的表达。Fig 5结果表明，假手术组未损伤的脊髓Nestin、GFAP、GAP43蛋白表达较少，模型组损伤14 d后，Nestin、GAP43、GFAP蛋白表达增加。给予SF治疗14 d后，Nestin和GAP43表达增加明显，GFAP表达减少。给予SF-HP水凝胶14 d后，观察到相似结果。由于在定性分析中无法比较SF-HP水凝胶与SF溶液对相关蛋白表达的影响，因此，采用Western blot进行定量研究。
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| Fig 5 Immunohistochemical staining results of GAP43, Nestin and GFAP 14 days after SCI(400x) |
如Fig 6所示，术后模型组大鼠脊髓的GFAP表达与假手术组相比明显增加(P < 0.01)，Nestin、GAP43表达无明显变化。给予SF治疗后，GFAP明显降低(P < 0.05)，而Nestin、GAP43表达增加(P < 0.05)；与SF溶液组相比，SF-HP水凝胶组GFAP表达下降更为明显(P < 0.05)，同时，Nestin、GAP43表达增加更为明显(P < 0.05)。
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| Fig 6 Effect of SF-HP on expression of GAP43, Nestin, GFAP in spinal cord of rats(x±s, n=5) A: Blots of GAP43, Nestin, GFAP expression in five groups; B: Analysis results of Western blot.**P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs SCI group; △P < 0.05 vs SF group |
脊髓损伤后的神经细胞死亡是主要源于继发性损伤，因为损伤后星形胶质细胞被大量激活，形成反应性星形胶质细胞，抑制营养因子的表达，同时上调抑制轴突生长相关蛋白的表达，阻碍受损神经元的修复和再生。SF具有抗神经凋亡作用[8]，研究发现，SF能改善脊髓损伤引起的运动功能障碍[2-3]，并且发现其可促进神经营养因子表达。但SF疗效不佳，主要原因在于传统给药方式的局限，导致药物无法达到损伤部位。
本实验采用新型合成材料HP包载SF，制备SF-HP水凝胶。该材料具有以下特点[9]：①适于人体应用的相变温度，可以在室温时呈液体状态，在人体温度(37℃)时迅速形成三维网状结构水凝胶，并保持较好的浸润性；②保持较好的抗凝活性，有利于防止神经瘢痕和周围血栓的形成。
实验结果表明，HP适宜浓度为17%的SF-HP水凝胶，胶凝温度符合要求。通常水凝胶在成凝胶态后弹性模量可达10 000 Pa左右，表明水凝胶具备一定的抗力性，与黏性模量占主要地位的溶液态相比，力学强度发生巨变。制得的SF-HP水凝胶已经符合这一点，为体内外实验中支撑细胞生长，促进组织修复奠定基础。凝胶具有明显的多孔状三维结构，微观结构显示其能在受损脊髓部位起到良好支撑作用，孔径大小均一的特点也适宜包载治疗药物，符合本研究的需求。
实验通过行为学研究，比较SF溶液与SF-HP水凝胶的疗效。结果发现，SF-HP水凝胶组疗效明显优于SF溶液组，并且给药后7 d就能观察到行为学的变化。而在给药14 d，HE染色发现，SF-HP水凝胶组能更好地改善损伤后的脊髓内部出血、组织水肿及脊髓结构空洞化。这一结果也印证SF确实具有改善脊髓损伤的作用，同时本研究结果也表明，SF-HP水凝胶能明显提高修复损伤脊髓的疗效。
确认神经损伤后是否具有再生能力，依靠行为学评价和病理学初步评价尚不完整的，故采用BDA顺行神经示踪技术，以更直观的角度观察神经轴突的修复和再生情况。BDA是研究神经功能变化的示踪剂，可被神经元摄取，并沿轴突转运，具有较好的稳定性[10]。示踪实验结果显示SF-HP水凝胶组大鼠腰椎(L2)段处有较强的绿色荧光，与正常组大鼠的神经传导功能无明显差异，并且荧光明显强于SF溶液组，表明经水凝胶包载的SF显示出优越的促受损脊神经轴突再生修复的能力，明显增强大鼠的神经传导功能。
脊髓损伤的恢复主要依赖于神经元轴突的修复与再生，而轴突再生受到多方面的影响，本实验通过对脊髓损伤神经修复通路的相关蛋白进行检测，初步揭示SF-HP水凝胶增强脊髓神经功能重建的机制。损伤后产生的反应性星形胶质细胞是神经元轴突再生的主要障碍，星形胶质细胞被激活成为反应性星形胶质细胞[11]。激活后的细胞发生改变，在损伤部位附近表达标志性的蛋白，改变损伤部位及其周边的微环境，抑制神经元生长及轴突再生，这是阻碍神经元轴突再生的主要因素[12]。Nestin是神经干细胞所特有的一种中间丝蛋白[13]；GAP43是神经生长相关类蛋白，在生长、分化和再生等各个阶段的轴突以及突触中含量极高，其表达可以反映神经轴突的生长及再生情况[14]；GFAP是星形胶质细胞的特异蛋白，可分析星形胶质细胞在脊髓损伤中的增生情况[15]。通过对以上蛋白进行免疫组化染色实验与蛋白质印迹实验，发现SF-HP水凝胶可以在脊髓损伤修复进程中，促GAP43和Nestin的表达，使神经干细胞数量增多，促使其分化生长，减少神经细胞中胶质的含量，逆转反应性星形胶质细胞导致的神经损伤。同时降低GFAP，抑制星形胶质细胞被激活，阻止反应性星形胶质细胞的生成。加之温敏优势，使其在体内温度下迅速转变为凝胶态，包载的SF与脊髓损伤部位产生良好接触，减少药物的流失和不良反应的发生，结合凝胶制剂缓慢释放药物的作用，使SF在受损脊髓周围得以长久停留，促进药物减少胶质瘢痕的形成，增强轴突再生的作用，利于对损伤脊髓的修复。
综上所述，本研究从行为学、病理学、电镜微观形态学及分子生物学多角度综合评价了SF-HP温敏型水凝胶对脊髓损伤的治疗作用，论证了HP温敏型水凝胶对SF疗效的增强作用，同时揭示了SF改善脊髓损伤的作用涉及神经营养机制与胶质瘢痕的抑制。
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