2. 福建中医药大学附属人民医院传统内科，福建 福州 350004
2. Dept of Traditional Medicine, People's Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, China
片仔癀(Pien Tze Huang，PZH)是我国的传统名贵中成药，具有悠久历史，配方及其制备工艺已被国家保密，该复方为国家一级中药保护品种，由麝香、牛黄、蛇胆、三七等名贵中药组成。常用于热毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、痈疽疔疮、无名肿毒及各种炎症，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效[1-2]。近年来，越来越多关于片仔癀对肝病的作用机制研究，郑海音等[3]研究发现，片仔癀对CCl4所致肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制与抑制NF-κB的表达有关；陈志亮等[4]研究发现，复方片仔癀肝宝一定程度上能够改善酒精性肝损伤的肝功能并能够通过抑制酒精引起的SREBP2和HMGCRa蛋白表达的升高，从而起到保护肝脏的作用；同时也有研究发现片仔癀对肝细胞性肝癌患者，可缓解疼痛、缩小瘤体、抑制肿瘤转移；能明显提高毒热瘀结型肝癌患者血液NK、CD4、CD4/CD8含量，改善患者经肝动脉化疗栓塞所致的免疫抑制，增强机体免疫功能而产生一定抗肝癌作用。
膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族成员之一，参与调控炎性反应、细胞凋亡、细胞分泌和信号传导等进程[5]，ANXA1是重要的炎性调控蛋白，能够参与炎性反应；且ANXA1表达的增加与NF-κB活性增强关系密切，NF-κB是一组具特殊DNA结合序列的转录因子[6]，诸多研究发现其能够控制细胞增殖和癌变，且可促进肿瘤的侵袭转移。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是分子量在40 000~45 000的同源二聚体糖蛋白，在肿瘤细胞和相邻免疫细胞中，以自分泌或旁分泌的方式影响着早期肿瘤血管的发生发展过程[7]。有研究表明，VEGF在肿瘤的发生发展过程中起到促进新生血管生成的作用[8]，同时为肿瘤细胞生长提供必需的氧气和营养物质[9-10]。
本文以ANXA1及其下游VEGF/VEGF受体、NF-κB信号通路为机制研究的切入点，通过研究片仔癀对人肝癌细胞HepG2的作用，从细胞水平阐明片仔癀抑制肝癌侵袭转移的作用机制，为其临床应用提供了理论基础，也为研究中药复方多靶点、多途径产生药效的机制提供一定借鉴。
1 材料 1.1 实验细胞人肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海生命科学研究院。
1.2 药品与试剂片仔癀(漳州片仔癀药业股份有限公司生产，规格：每粒重3 g，批号：0908035)；胎牛血清(HyClone，货号：SV 30087.02)；β-Actin抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：AA128)；PCNA抗体(Cell Signaling Technology，货号：#13110)；Bax抗体(Cell Signaling Technology，货号：#5023)；Bcl-2抗体(Cell Signaling Technology，货号：#15071)；cleaved caspase-3抗体(Cell Signaling Technology，货号：#9661)；cleaved caspase-9抗体(Cell Signaling Technology，货号：#20750)；ANXA1抗体(Abcam，货号：ab97485)；VEGF抗体(Cell Signaling Technology，货号：#2463)；VEGFR抗体(Cell Signaling Technology，货号：#9698)；NF-κB p50抗体(Cell Signaling Technology，货号：#3035)；总RNA提取试剂盒(QIAGEN，货号：74104、74106)；cDNA逆转录试剂盒(Fermentas，货号：K1622)；TaqMan® Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，货号：R11022)；超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：P0018)。
1.3 实验仪器荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，型号：7900HT)；多功能酶标仪(TECAN，型号：Infinite M200 Pro)；小型垂直电泳槽(Bio-rad，型号：Mini PROTEAN Tetra)；小型转印槽(Bio-rad，型号：Mini Trans-Blot)；凝胶成像系统(Bio-rad，型号：ChemiDoc XRS+)。
2 方法 2.1 细胞培养采用含有10% FBS，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1链霉素的RPMI1640培养液培养HepG2细胞，置于6孔板培养3 h(37 ℃，5% CO2)。用培养基小心清洗未黏附的细胞，然后加入含有10% FBS，rhGM-CSF(1 000 U·mL-1)，50 U·mL-1青霉素和50 mg·L-1链霉素的RPMI1640培养液，每2天置换一半新鲜培养液。
2.2 MTT实验取对数生长期的HepG2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化5min，收集培养瓶中细胞。用RPMI1640培养液制备成细胞悬液，并对细胞进行计数，使细胞密度为1×105个·mL-1。之后将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔为100 μL，培养12 h，使细胞贴壁生长。细胞分为空白对照组(Normal)、片仔癀不同浓度剂量组(浓度分别为1、10、100 mg·L-1)，每孔DMSO的使用浓度为0.5%，每组细胞设6个重复复孔，培养24 h后，吸弃孔中的培养液，并每孔加入已配好的MTT溶液10 μL，MTT浓度为5 mg·mL-1，于37 ℃孵育4 h后吸弃各孔中的培养液，加入100 μL的DMSO，振荡混匀2min，使结晶充分溶解，用多功能酶标仪测定各孔吸光度值(即A值)，检测波长为570 nm，细胞活力的计算公式如下。
HepG2细胞活力/%=[各实验组A值/对照组A值]×100%。
2.3 集落形成实验取对数生长期的HepG2细胞，6孔板每孔接种2×105个细胞，培养12 h后，分别用片仔癀不同浓度剂量组(浓度分别为1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1)作用，培养24 h，每孔接种2×105细胞于6孔板，用RPMI1640培养液培养，隔天更换1次培养，培养时间为7~8 d，在倒置显微镜下，观察并计算集落形成的情况与数量。
2.4 Western blot检测蛋白表达提取细胞总蛋白，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配置合适浓度的分离胶。上样，电泳至蓝色带刚好跑到凝胶底部时终止电泳。转膜成功后TBS洗一遍，把PVDF膜浸泡在封闭液中，置于摇床上室温封闭2 h。孵育一抗：封闭好的PVDF膜用TBS洗涤10 min，按抗体说明书提供稀释比例加入一抗稀释液，各一抗稀释倍数分别为Bax一抗(1 :800)、Bcl-2一抗(1 :800)、cleaved caspase-3一抗(1 :800)、cleaved caspase-9一抗(1 :600)、ANXA1一抗(1 :800)、VEGF一抗(1 :800)、VEGFR一抗(1 :800)、NF-κB p50一抗(1 :600)、PCNA(1 :3 000)、β-actin(1 :3 000)。4 ℃孵育过夜。孵育二抗，摇床室温孵育2 h。收集二抗稀释液，PVDF膜用TBS洗涤(10 min×3)，显影。
2.5 统计学分析用SPSS20.0统计软件进行统计学处理，所有结果用x±s来表示。各组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 不同浓度的片仔癀对HepG2细胞活性的影响用MTT比色法检测各组HepG2细胞的活性，研究发现，与空白对照组比较，经不同浓度片仔癀处理后，A值明显升高(P < 0.05)，且随着片仔癀浓度的升高，抑制作用也逐渐增强，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of PZH on activity of MTT of HepG2 (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal |
用集落形成实验检测不同浓度的片仔癀对HepG2细胞集落形成能力(即细胞存活能力)的影响，研究发现，与空白对照组比较，不同浓度的片仔癀能够抑制HepG2细胞集落形成数量，且随着片仔癀浓度的升高，对HepG2细胞存活的抑制作用也增强(P < 0.05)，见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of PZH on HepG2 cell survival (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal |
研究发现，与空白对照组比较，经不同浓度片仔癀作用后，能够促进细胞凋亡的Bax，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9蛋白的表达，同时抑制Bcl-2蛋白的表达，结果表明，片仔癀对HepG2细胞的凋亡相关蛋白具有一定作用，且随着片仔癀浓度升高，对HepG2细胞凋亡的抑制作用也增强，见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of salidroside on Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 protein expression of HepG2 (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal |
研究发现，与空白对照组比较，经不同浓度片仔癀作用后，能够促进ANXA1蛋白表达，且随着片仔癀浓度升高，ANXA1蛋白也升高；同时，片仔癀能够抑制VEGF及其受体VEGFR的蛋白表达，且随着片仔癀浓度的升高，其抑制作用增强；提取HepG2细胞细胞核蛋白，检测NF-κB p50核转录水平，结果表明，片仔癀能够抑制NF-κB p50核转录水平，且随着片仔癀浓度的升高，其抑制作用增强，见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of salidroside on ANXA1, VEGF, VEGFR protein and NF-κB p50 nuclear protein expression of HepG2 (x±s, n=6) **P < 0.01 vs normal |
肝癌在全球癌症发病率排名第六位，其致死人数排名第四位的恶性肿瘤[8]。目前早期肝细胞癌的治疗主要以外科手术切除为首选[9]，但术后复发率高，预后较差。因此，探索抑制肝细胞癌发生发展的分子机制，寻找更有效安全治疗药物是当务之急。片仔癀是我国的传统名贵中成药，常用于急慢性病毒性肝炎，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效。近年来，越来越多关于片仔癀对肝细胞性肝癌患者的研究，本文主要研究片仔癀对人肝癌细胞系HepG2作用的影响，结果表明，片仔癀能够抑制HepG2细胞活性及抑制HepG2细胞集落形成数量(即细胞存活能力)。
肿瘤细胞是通过在细胞内外过度表达抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，对细胞凋亡抵抗，从而导致肿瘤生长控制的丧失[10-11]。Bcl家族的蛋白在细胞凋亡过程中起到非常重要的引导作用，主要包括促凋亡基因，如Bax，及抗凋亡基因，如Bcl-2[12-13]。caspase-3是由CASP3基因编码的，外部死亡受体途径和内在线粒体途径启动后共同的效应酶，在肝癌细胞凋亡中明显表达[14]。而caspase-9由CASP9基因编码的凋亡启动蛋白酶，通过磷酸化再进行调控激活，引发线粒体内部活化凋亡途径，诱导细胞凋亡是癌症治疗中细胞死亡的首选模式[15]，是癌症治疗关键。本研究通过检测片仔癀对HepG2细胞凋亡相关蛋白的影响，发现片仔癀可以促进促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表达，减少抗凋亡基因Bcl-2的表达，对凋亡相关蛋白具有调控作用。
为进一步探讨片仔癀抑制HepG2细胞活性及对凋亡相关蛋白调控作用的机制，本研究立足于ANXA1及下游通路的活化，ANXA1参与调控细胞凋亡和信号传导等进程[5]，ANXA1表达的增加与NF-κB活性增强关系密切，NF-κB能够控制细胞增殖和癌变，且可促进肿瘤的侵袭转移；VEGF在肿瘤细胞和相邻免疫细胞中，以自分泌或旁分泌的方式影响着早期肿瘤血管的发生发展过程[7]。在此基础上，本研究发现片仔癀可以促进ANXA1蛋白表达，抑制其下游蛋白VEGF及其受体VEGFR的表达，抑制血管内皮细胞生长因子分泌作用；同时，其能够抑制核蛋白NF-κB p50核转录水平，作用于肿瘤炎症。
综上所述，片仔癀能够抑制肿瘤细胞HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡，与其能够促进ANXA1蛋白表达，抑制VEGF及其受体VEGFR，进而抑制核蛋白NF-κB p50核转录水平，促进促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段的表达，减少抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。本实验研究结果表明，片仔癀具有潜在的抗癌作用，利用细胞实验探讨片仔癀对肝癌细胞的作用及其分子机制，以期为临床应用片仔癀治疗肝癌提供新的理论根据，为肝癌的药物治疗开辟新途径。
( 致谢: 本实验在福建中医药大学生物医药研发中心完成，感谢各位老师的帮助与支持！)
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