2. 厦门大学药学院，厦门大学附属中山医院胃肠外科，福建 厦门 361101
2. School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University; Dept of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen Fujian 361101, China
化学疗法和放射疗法是癌症的主要治疗方法，治疗过程中会破坏健康细胞[1]，损害造血系统[2]，严重者可出现骨髓抑制[3]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是临床常用一线化疗药，作用机制主要是抑制胸苷酸合成酶，以干扰DNA合成，达到抗癌作用[4]。临床治疗中，5-Fu常规剂量持续使用不仅杀伤癌细胞，严重者还抑制骨髓造血功能，引起骨髓抑制严重损伤[5]。蛎昆一号制剂主要由昆布、黄芪、女贞子、茯苓等中草药组成，具有软坚散结，养血活血，清热利湿，益气健脾之功效。
JAK/信号转导子和转录活化子(signal transducer and activators of transcription，STAT)信号通路与细胞生长、增殖、分化和成熟关系密切，其中JAK2/STAT5与红系细胞的分化成熟密切相关[6]。已有研究证明，JAK2/STAT5信号通路参与骨髓抑制后的缺血反应，促进造血系统恢复，减轻不良反应[7]。本研究拟建立骨髓抑制模型，探究蛎昆一号制剂对5-Fu造模小鼠骨髓造血功能的影响，阐述其减轻小鼠骨髓抑制的作用及其作用机制，同时为中药复方制剂对治疗肿瘤化疗药所致骨髓抑制提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级健康♂ BALB/c小鼠60只，6~8周龄，体质量(18~22) g，购自厦门大学实验动物中心，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。
1.2 药物与试剂蛎昆制剂由昆布、牡蛎、黄芪、女贞子、茯苓等中药组成(已申请专利)。蛎昆一号制剂，为蛎昆复方制剂的一号制剂，简称蛎昆一号制剂，由昆布、黄芪、女贞子、茯苓等中草药组成。昆布、黄芪、茯苓、女贞子(安徽健诚中药饮片有限公司); 5-Fu(天津金耀药业有限公司); 重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)，购自厦门特宝生物工程股份有限公司; BCA蛋白浓度测定试剂盒、IP细胞裂解液(生工生物工程股份有限公司); β-actin、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5抗体(Cell Signaling Technology公司); TNF-α、IL-2的ELISA试剂盒(深圳市达科为生物工程有限公司)。
1.3 仪器ChemiDoc TM XRS+型凝胶成像仪、ImageLab图像分析系统; 全自动血球分析仪BC-2300(上海恒盛医疗器械有限公司); DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂); iMark酶标仪(美国伯乐公司)。
1.4 模型的建立及分组给药参照文献[8]进行骨髓抑制模型造模。将小鼠随机分为6组，即正常对照组(Control)、模型组(Model)、阳性对照组(rhG-CSF)、蛎昆一号制剂组低(Low)、中(Medium)、高(High)3个剂量，每组10只。模型组小鼠腹腔注射5-Fu 250 mg·kg-1(对照组腹腔注射等容积生理盐水)，造模24 h后开始给药，连续7 d。按文献[9]计算小鼠蛎昆一号制剂的等效剂量为200 mg·kg·d-1，并以此将蛎昆一号制剂分为低、中、高剂量组，灌胃剂量分别为133、200、300 mg·kg·d-1，灌胃体积为20 mL·kg-1; 阳性对照组每只小鼠腹腔注射rhG-GSF 250 μg·kg·d-1，体积为10 mL·kg·d-1。
1.5 一般情况观察及体质量测定每天观察小鼠的精神状态，进食量，每日给药前测量一次体重。
1.6 外周血细胞计数各组小鼠最后一次给药24 h(d 7)后取眼球血。用全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞、血小板、淋巴细胞及单核细胞含量。
1.7 ELISA法检测TNF-α和IL-2含量各组小鼠最后一次给药24 h(d 7)后，取眼球血于EP管中，室温放置0.5 h，4 ℃放置2 h，3 000 r·min-1离心2次，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作。
1.8 Western blot法检测相关蛋白表达各组小鼠最后一次给药24 h(d 7)后，将小鼠颈椎脱臼处死，提取小鼠脾脏组织蛋白，用于p-JAK2和p-STAT5的检测，将提取的蛋白采用BCA法进行蛋白定量。制样后SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5% BSA封闭2 h，加入一抗β-actin(1 :5 000)、JAK2(1 :500)、p-JAK2(1 :500)、STAT5(1 :500)、p-STAT5(1 :500), 4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，加入山羊抗兔二抗(1 :5 000)，室温孵育1 h，漂洗，加入ECL工作液，在凝胶成像仪上显色，用凝胶图像处理系统分析条带的灰度值。
1.9 统计学分析采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，各组数据进行方差齐性检验，组间比较采用Dunnett法。
2 结果 2.1 一般情况观察正常组小鼠活动正常，粪便正常。模型组小鼠7 d呈明显的消瘦状态，体质量不同程度减轻，粪便为水样粪便。蛎昆一号制剂低、中、高剂量及阳性对照组(rhG-CSF)小鼠腹泻症状改善(Fig 1)。
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| Fig 1 The anal status photo of mouse A: Control; B: Model; C:rhG-CSF; D:Likun preparation No.1 low dose; E:Likun preparation No.1 medium dose; F:Likun preparation No.1 high dose. |
Tab 1结果显示，与模型组相比，蛎昆一号制剂低剂量组及阳性对照组小鼠体质量差异有显著性(P＜0.05)，中、高剂量组效果不明显。
| Group | Before model | Day 7 |
| Control | 23.33±1.25 | 24.31±1.29 |
| Model | 23.19±1.25 | 19.86±0.93## |
| rhG-CSF | 24.08±1.36 | 22.10±2.51* |
| Low | 23.83±1.39 | 22.39±1.16** |
| Medium | 23.73±0.83 | 21.60±1.38 |
| High | 22.77±1.32 | 21.14±2.14 |
| ##P＜0.01 vs control; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||
Tab 2结果显示，与模型组相比，蛎昆一号制剂及rhG-CSF组外周血白细胞、淋巴细胞均明显升高(P＜0.05)。蛎昆一号制剂中、高剂量血小板均明显升高(P＜0.01)。蛎昆一号制剂及rhG-CSF组外周血淋巴细胞比率均明显降低(P＜0.05)。
| Group | WBC/×109·L-1 | MO/% | LY/×109·L-1 | PLT/×109·L-1 |
| Control | 3.3±0.5 | 0.5±0.3 | 3.2±0.7 | 938.6±45.9 |
| Model | 1.1±0.4## | 1.4±0.5## | 1.0±0.3## | 76.1±31.3## |
| rhG-CSF | 1.8±0.9* | 0.7±0.4** | 1.8±0.9* | 110.6±46.3 |
| Low | 1.5±0.4* | 0.7±0.5** | 1.5±0.4* | 93.4±38.2 |
| Medium | 2.2±0.5** | 0.6±0.3** | 2.2±0.5** | 159.6±38.9** |
| High | 1.8±0.6* | 0.5±0.2** | 1.8±0.5** | 159.5±24.7** |
| ##P＜0.01 vs control; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||||
Tab 3的ELISA结果显示，与正常组比较，模型组IL-2含量明显下降、TNF-α含量明显上调; 与模型组比较，蛎昆一号制剂中、高剂量组IL-2含量升高(P＜0.05)，低剂量组及阳性对照组效果不明显; 蛎昆一号各剂量组及阳性对照组TNF-α含量明显下降(P＜0.05)。
| Group | TNF-α | IL-2 |
| Control | 71.48±4.68 | 2 313.92±113.12 |
| Model | 188.25±4.50## | 1 834.09±97.36# |
| rhG-CSF | 80.07±5.82** | 1 538.82±78.71 |
| Low | 86.52±4.05** | 1 821.94±104.27 |
| Medium | 82.07±2.56** | 2 128.69±61.52* |
| High | 85.62±3.44** | 2 096.20±60.81* |
| #P＜0.05, ##P＜0.01 vs control; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||
Fig 2的Western blot检测结果显示，模型组小鼠脾脏组织p-JAK2、p-STAT5蛋白表达减少(P＜0.05);与模型组比较，蛎昆一号制剂各剂量组脾脏组织p-JAK2、p-STAT5蛋白表达明显上调(P＜0.05)。
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| Fig 2 Western blot analysis of targetprotein in mouse spleen(x±s, n=10) ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model |
临床上，造血功能障碍的治疗主要是通过直接输血治疗或应用一些具有骨髓抑制保护的药物，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素等，但这些治疗药物需要不断重复给药，会引起不良反应，如外周白细胞减少症和骨髓抑制。本实验中，腹腔注射5-Fu，模型组小鼠出现腹泻、体质量下降等症状，外周血血细胞(白细胞、淋巴细胞、血小板)数均明显降低，表明DNA受损，骨髓抑制形成，这些均提示以250 mg·kg-1 5-Fu制备骨髓抑制模型是可行的。
蛎昆一号制剂主要由昆布、黄芪、媜子和茯苓组成，其主要成分分别为昆布多糖、黄芪多糖、女贞子多糖、茯苓聚糖。其中昆布多糖能预防高血压、糖尿病、抗肿瘤和保护血管内皮细胞[10]; 黄芪多糖能促进小鼠骨髓造血细胞系统恢复[11]; 女贞子多糖具有抗实体肿瘤作用，提高机体免疫力[12]; 茯苓聚糖具有抗炎、抗氧化和免疫调节活性[13]。前期研究发现，蛎昆一号制剂能提高骨髓造血功能，增强小鼠免疫功能[14]。本研究中，蛎昆一号制剂各剂量组给药后，骨髓抑制小鼠的外周血淋巴细胞、血小板均有明显升高，表明蛎昆一号制剂可促进骨髓造血功能的恢复。造血细胞的增殖和分化受可溶性多肽-细胞因子的调节，包括白细胞介素、干扰素、G-CSF和促红细胞生成素[15]。由IL-2调节的造血细胞活化与STAT5和JAK2的激活有关。IL-2通过调节骨髓中T细胞的活性，来帮助维持红细胞生成[16]。但是，长期化疗/放疗严重损害造血系统，并导致来自宿主细胞促炎症因子TNF-α释放，异常TNF-α的分泌可直接抑制骨髓造血功能。小鼠血清ELISA结果显示，蛎昆一号制剂给药后，造血功能障碍的小鼠血清中TNF-α下调、IL-2上调，进一步说明蛎昆一号制剂能一定程度上增强小鼠细胞免疫功能，产生抗肿瘤作用。
JAK/STAT途径广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等过程[17]。5-Fu引起骨髓抑制, 导致细胞增殖和分化进程停滞。本实验检测p-JAK2和p-STAT5的蛋白表达。结果显示，5-Fu引起p-JAK2和p-STAT5蛋白表达降低，表明与造血密切相关的JAK2/STAT5信号转导通路也受到了抑制。中、高剂量的蛎昆一号制剂治疗后，促进了p-JAK2和p-STAT5的表达，表明蛎昆一号制剂激活了JAK2/STAT5信号通路。由于JAK2/STAT5与红系细胞分化发育关系最为密切[6], 我们推测蛎昆一号制剂可能具有促进骨髓造血细胞红系分化的作用。总之，该研究的结果表明，蛎昆一号制剂对5-Fu诱导的小鼠骨髓抑制有保护作用，其作用机制与JAK2/STAT5途径的激活有关。
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