2. 福建中医药大学附属人民医院药学部，福建 福州 350004
2. Dept of Pharmacy, People's Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, China
红景天(Rhodiola rosea L.)是景天科植物，生长于海拔3 500米以上的天然植物，中国药典2015版记载红景天的功能与主治为“益气活血，通脉平喘，主要用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘”。红景天苷(salidroside)是红景天的主要有效成分，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能等多种药理作用。课题组前期研究发现，红景天苷能够降低大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠脑梗死体积，改善神经功能损伤[1-6]。有研究表明[7]，激活PI3K/mTORC2/Akt信号途径，能够降低磷酸化IκBα的水平，从而减少NF-κB p50亚基向细胞核的转移，抑制炎症因子的释放，故激活PI3K/Akt信号途径具有抗炎的作用。因此，本文主要研究红景天苷调控PI3K/Akt信号通路，对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞的抗炎作用，进而探讨红景天苷的作用机制。
1 材料 1.1 细胞株BV2小胶质细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院。
1.2 药物与试剂红景天苷(由福建中医药大学提供，纯度≥98%); 胎牛血清(HyClone，货号：SV 30087.02);Akt抗体(货号：#2920)、p-Akt抗体(货号：#4060)、NF-κB p50抗体(货号：#3035)，均购自Cell Signaling Technology公司; β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司，货号：AA128);RNeasy® Mini Kit(QIAGEN，货号：74104);RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，货号：K1622);TaqMan® Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，货号：R11022);超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：P0018);PI3K抑制剂LY294002(Sigma，货号：L9908)。
1.3 仪器7900HT荧光定量PCR仪(Applied Biosystems); Infinite M200 Pro多功能酶标仪(TECAN); ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-Rad)。
2 方法 2.1 细胞培养BV2小胶质细胞接种在25 cm2细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的改良型RPMI 1640培养液，置于37 ℃细胞培养箱中培养、传代。
2.2 实验分组与处理BV2细胞处于对数生长期，将细胞分为5组：正常对照组(Normal组)、LPS模型组(Model组)、模型+红景天苷(1、10、100 μmol·L-1)组。待细胞长到80%后，吸出培养基，用PBS清洗1遍，加入LPS(终浓度为100 nmol·L-1)，之后给药组立即加入相应浓度的红景天苷，正常对照组加入相同的溶剂，细胞继续培养48 h，收集样品备用。
2.3 PI3K抑制剂实验实验分组：正常组(Normal组)、模型组(Model组)、模型+红景天苷组(Model+Sal组)、模型+PI3K抑制剂LY294002组(Model+LY组)、模型+PI3K抑制剂LY294002+红景天苷组(Model+LY+Sal组)。以2×108·L-1的浓度接种BV2细胞至24孔培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基0.5 mL，LY294002(终浓度为50 nmol·L-1)加入30 min后，加入LPS造模，同时加入红景天苷(10 μmol·L-1)，细胞继续培养48 h后收集样品备用。
2.4 qPCR法检测相关基因的表达提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照GenBank中大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α的引物序列，IL-6引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR扩增片断长度为129 bp; IL-1β引物上游序列5′-ACAAGGAGAGACAAGCAACGACAA-3′，下游序列5′-TTTCCATCTTCTTCTTTGGGTATTG-3′，PCR扩增片断长度为149 bp; TNF-α引物上游序列5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′; 下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR扩增片断长度为149 bp; GAPDH引物上游序列5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR扩增片断长度为96 bp。
2.5 Western blot检测相关蛋白的表达提取细胞总蛋白及核蛋白，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配制合适浓度的分离胶。上样，电泳至蓝色带刚好跑到凝胶底部时终止电泳。转膜成功后，TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封闭液中，置于摇床上室温封闭2 h。封闭好的PVDF膜用TBS洗涤10 min，加入一抗Akt(1 :1 000)、p-Akt(1 :1 000)、NF-κB p50 (1 :800)、β-actin(1 :3 000)，4 ℃孵育过夜。加入二抗，摇床室温孵育2 h。PVDF膜用TBS洗涤10 min×3次，显影。
2.6 统计学分析用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，所有结果用x±s表示。各组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐，采用LSD法，方差不齐，则采用Games-Howell法。
3 结果 3.1 红景天苷对BV2小胶质细胞LPS损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响Fig 1的qPCR结果显示，BV2小胶质细胞经100 nmol·L-1 LPS处理后，与Control组比较，Model组中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达明显升高; 经不同浓度红景天苷处理后，IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达明显下降，且呈浓度依赖性，100 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好。
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| Fig 1 Effect of salidroside on expression of IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA of BV2 cells after LPS-induced injury (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
与Control组比较，Model组中p-Akt/Akt的比值降低，核蛋白NF-κB p50蛋白表达升高; 经不同浓度红景天苷处理后，p-Akt/Akt比例升高，核蛋白NF-κB p50蛋白表达降低，且呈浓度依赖性，100 μmol·L-1红景天苷作用的效果最好(Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of salidroside on p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50 (B) protein expression of BV2 cells after LPS-induced injury (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
如Fig 3所示，Model+Sal组与Model组相比，p-Akt表达升高，核蛋白NF-κB p50表达降低; 经PI3K抑制剂LY294002作用后，Model+LY+Sal组与Model+Sal组比较，p-Akt表达降低，核蛋白NF-κB p50表达升高，且Model+LY+Sal组与Model+LY组比较，p-Akt及核蛋白NF-κB p50表达水平差异无显著性。结果提示，LY294002通过抑制PI3K/Akt通路，促进NF-κB p50核转录，同时，红景天苷通过PI3K/Akt通路能够抑制NF-κB p50核转录水平。
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| Fig 3 Effect of PI3K inhibitor on expression of p-Akt, Akt(A) and nuclear NF-κB p50(B) protein expression in BV2 cells after LPS-induced injury (x±s, n=6) **P < 0.01 vs model; ##P < 0.01 vs Model+Sal |
Fig 4的qPCR结果显示，Model+Sal组与Model组相比，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达降低; 经PI3K抑制剂LY294002作用后，Model+LY+Sal组与Model+Sal组比较，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平明显升高，且Model+LY+Sal组与Model+LY组比较，IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平差异无显著性。结果提示，LY294002通过抑制PI3K/Akt通路，进而抑制红景天苷对BV2小胶质细胞IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达的作用。
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| Fig 4 Effect of PI3K inhibitor on expression of IL-6, IL-1β, TNF-α mRNA in BV2 cells after LPS-induced injury (x±s, n=6) **P < 0.01 vs model; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model+ Sal |
小胶质细胞在免疫抑制、炎症网络激活过程中扮演着重要角色，并且能释放细胞因子，促进炎症反应，炎性反应作为众多疾病的基础病变，与疾病的发生、发展密切相关[8]。IL-6、IL-1β和TNF-α是重要的炎症因子，可以促进炎症反应和组织损伤[9]。NF-κB信号通路在调节免疫应答、炎症反应中起关键作用，与炎性因子合成分泌息息相关[10]。本实验采用LPS诱导BV2小胶质细胞炎症损伤模型，LPS可以诱导小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6，促进NF-κB p50核转录水平，经不同浓度红景天苷作用后，能够抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达，以及NF-κB p50核转录水平，呈明显的浓度依赖性。
PI3K/Akt信号转导通路具有调控细胞迁移、增殖、存活等多种生物学功能，是体内外重要的存活途径。目前，PI3K抑制剂包括单纯PI3K抑制剂(pan-PI3K inhibitors)和选择性PI3K抑制剂(selective PI3K inhibitors)两种。本实验采用广泛应用的LY294002进行研究，LY294002是一种分子质量为307.34的化合物，属于单纯PI3K抑制剂，可同时抑制PI3K p110α、PI3K p110β和PI3K p110δ三个亚型，使下游多条信号通路失活，已广泛用于脑缺血/再灌注损伤机制研究。本实验进一步探讨红景天苷对BV2小胶质细胞的抗炎作用机制。研究发现，红景天苷能够促进Akt的磷酸化，经PI3K抑制剂LY294002作用后，能够阻断红景天苷对核蛋白NF-κB p50及炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的作用。
综上所述，红景天苷通过调控PI3K/Akt信号通路，进而减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。
( 致谢: 本实验在福建中医药大学生物医药研发中心完成，感谢各位老师的帮助与支持！)
| [1] |
赖文芳, 张小琴, 洪海棉, 等. 红景天苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(6): 775-9. Lai W F, Zhang X Q, Hong H M, et al. Neuroprotective effects of salidroside against focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(6): 775-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.06.008 |
| [2] |
Lai W, Xie X, Zhang X, et al. Inhibition of complement drives increase in early growth response proteins and neuroprotection mediated by salidroside after cerebral ischemia[J]. Inflammation, 2018, 41(2): 449-63. doi:10.1007/s10753-017-0701-7 |
| [3] |
Lai W, Zheng Z, Zhang X, et al. Salidroside-mediated neuroprotection is associated with induction of early growth response genes (Egrs) across a wide therapeutic window[J]. Neurotox Res, 2015, 28(2): 108-21. doi:10.1007/s12640-015-9529-9 |
| [4] |
宋百颖, 赖文芳, 苏燕青, 等. 红景天苷通过抑制补体C3的表达对MCAO大鼠缺血侧NeuN、Egr4影响的研究[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(11): 1579-84. Song B Y, Lai W F, Su Y Q, et al. Effects of salidroside on expression of NeuN and Egr4 in ischemic side of MCAO rats by inhibiting expression of C3[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(11): 1579-84. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.020 |
| [5] |
谢秀利, 洪海棉, 赖文芳, 等. 红景天苷对大脑中动脉闭塞模型大鼠的神经保护作用[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(10): 1452-7. Xie X L, Hong H M, Lai W F, et al. Protective effects of salidroside in MCAO rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(10): 1452-7. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.025 |
| [6] |
张小琴, 苗学蒸, 周丽英, 等. 红景天苷对局灶性脑缺血/再灌注大鼠轴突再生及Akt/GSK-3β/CRMP-2表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(9): 1320-4. Zhang X Q, Miao X Z, Zhou L Y, et al. Salidroside regulates Akt/GSK-3β/CRMP-2 expression and axonal regeneration in MCAO rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(9): 1320-4. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.025 |
| [7] |
Lai W, Tian X, Xiang Q, et al. 11β-HSD1 modulates LPS-induced innate immune responses in adipocytes by altering expression of PTEN[J]. Mol Endocrinol, 2015, 29(4): 558-70. doi:10.1210/me.2014-1287 |
| [8] |
Annovazzi L, Mellai M, Bovio E, et al. Microglia immunophenotyping in gliomas[J]. Oncol Lett, 2018, 15(1): 998-1006. |
| [9] |
Atretkhany K N, Drutskaya M S, Nedospasov S A, et al. Chemokines, cytokines and exosomes help tumors to shape inflammatory microenvironment[J]. Pharmacol Ther, 2016, 168: 98-112. doi:10.1016/j.pharmthera.2016.09.011 |
| [10] |
Yang T, Martin P, Fogarty B, 等. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in Danio rerio[J]. Pharm Res, 2015, 32(6): 2003-14. |