2. 武汉市第三医院(武汉大学附属同仁医院)放射科，湖北 武汉 430061;
3. 武汉市普仁医院心内科，湖北 武汉 430080
2. Dept of Radiology, Wuhan Third Hospital (Tongren Hospital of Wuhan University), Wuhan 430061, China;
3. Dept of Cardiology, Wuhan Puren Hospital, Wuhan 430080, China
流行病学调查表明，糖尿病患者心血管疾病患病率是非糖尿病人群心血管疾病的2~3倍[1]，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者严重的心血管并发症之一，研究DCM发病机制对寻找防治DCM的方法具有重要意义。近年来研究表明，自噬现象和DCM关系密切。在糖尿病转基因小鼠模型中，自噬是上调的，过表达Beclin-1促进过度自噬，导致了心肌肥厚加重，提示过度自噬导致了DCM。我们前期研究建立的DCM大鼠模型中心肌自噬是降低的，而且心肌纤维化明显[2]。
所谓自噬，就是通过激活自噬相关蛋白诱导自噬发生，降解细胞内长寿命蛋白、损伤蛋白及细胞器，并对降解后成分再利用[3]。生理条件下的自噬作为细胞应激的保护机制，处于一种持续的低水平状态，然而，环境非理性的变化会导致自噬过度激活，引起细胞程序性死亡。对于心肌细胞而言，适度的自噬对其功能维持起着重要作用，但也可能会引起心肌疾病[4]。
乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)最先发现于神经细胞合成的神经递质，后来人们逐渐认识到，ACh在非神经组织如上皮、内皮、间皮等细胞中广泛存在。通过自分泌或旁分泌作用，ACh可参与自身和临近细胞基本功能的调节，如增殖、分化、凋亡、分泌、黏附、免疫功能等。心肌细胞可合成、释放ACh，同样，心肌细胞也分布着各种ACh受体(M、N受体)。研究表明，ACh激活M受体促进心肌细胞自噬，可减少缺氧/复氧过程中心肌凋亡[5]。但对于神经递质在DCM中的作用不甚明确，既然自噬在DCM中有重要意义，而且ACh可调节心肌细胞自噬活性，那么ACh是否在DCM发生、发展中有一定的作用？本研究建立高糖诱导心肌细胞损伤模型，探讨ACh能否改善高糖导致的心肌细胞损伤，并探究自噬在其中的作用及其机制，为治疗DCM提供新的治疗途径。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株大鼠心肌细胞系H9c2细胞，购自中国科学院细胞库。
1.1.2 试剂ACh、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，Rap)、AICAR(AMPK激活剂)，购自Sigma公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，购自ScienCell公司；β-actin抗体、二抗，购自中杉金桥公司；LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62抗体，购自Cell Signaling Technology公司；AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、p-mTOR、mTOR抗体，购自Abcam公司；MTT、ATP、BCA试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 仪器生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)；倒置生物显微镜(日本Olympus公司)；全波段酶标仪(美国Thermo公司)；全套蛋白电泳电转装置(美国Bio-Rad公司)；超薄切片仪(德国Leica公司)；透射电镜(日本JEOL公司)。
1.2 细胞培养与分组将H9c2心肌细胞复苏后，在含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中培养，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中，培养基2~3 d更换1次，待细胞贴壁生长至70%~80%时，消化收集细胞进行传代，实验所用细胞为7~15代细胞。实验分为6组：(1)对照组(control)：用正常浓度葡萄糖培养基培养H9c2细胞72 h；(2)高糖(high glucose，HG)组：用含终浓度为30、17 mmol·L-1葡萄糖的培养基[6]培养H9c2细胞72 h；(3)不同浓度ACh组：在含有30 mmol·L-1葡萄糖的心肌细胞培养基中，同时分别加入10-6、10-5、10-4 nmol·L-1的ACh培养H9c2细胞72 h；(4)HG+3-MA组：在终浓度为30 mmol·L-1葡萄糖培养基中，同时加入2 mmol·L-1的3-MA，培养H9c2细胞72 h; (5)HG+ACh+Rap组：在终浓度为30 mmol·L-1葡萄糖培养基中，同时加入50 nmol·L-1的Rap及10-4 nmol·L-1的ACh，培养H9c2细胞72 h; (6)HG+ACh+AICAR组：在终浓度为30 mmol·L-1葡萄糖培养基中同时加入10-4 nmol·L-1的ACh及0.5 mmol·L-1 AICAR[7]，培养H9c2细胞72 h。3-MA及Rap浓度借鉴于我们前期的实验研究[8]。
1.3 MTT法检测细胞活性取生长对数期细胞铺板，每孔约104个细胞，每个药物浓度设置5个复孔，同时设置调零孔和对照孔，药物处理结束后，加入10 μL MTT溶液，4 h后，加入150 μL二甲基亚砜充分溶解结晶，利用酶联免疫检测仪在490 nm处测量吸光度值(OD)。细胞相对活性=(药物组OD平均值-空白组OD值平均值)/(对照组OD值平均值-空白组OD值平均值)。
1.4 ATP含量的检测按BCA蛋白提取试剂盒提取总蛋白，计算蛋白浓度，利用ATP试剂盒提供的ATP标准品制作出标准曲线，将待测样品稀释成不同浓度梯度，向96孔板中加入待测样品，混匀后，用化学发光仪测定相对光单位(relative light unit, RLU)值，最后根据标准曲线计算出待测样品中ATP的浓度，根据蛋白浓度，将ATP的浓度换算成μmol·g-1蛋白的形式。
1.5 Western blot检测取出药物处理后的H9c2细胞，在冷的RIPA蛋白裂解液中充分裂解。将裂解物离心后，收集上清液进行蛋白分析，应用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。取20 μg蛋白，经SDS-PAGE分离后，转移到NC膜或PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后加入一抗(LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62、p-mTOR、mTOR的稀释比例均为1:1 000，p-AMPK、AMPK稀释比例为1:2 000，β-actin稀释比例为1:10 000)，4 ℃孵育过夜，用PBST清洗干净后，放入二抗中室温孵育2 h，用ECL曝光显色，利用ImageJ软件分析结果，检测蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
1.6 透射电镜观察细胞自噬体将处理的H9c2细胞用2.5%戊二醛固定2 h，然后用1%锇酸固定液固定2~3 h，最后用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗15 min，共3次，依次经不同浓度梯度的乙醇脱水后，将其包埋在环氧树脂中。使用超薄切片仪切成70 nm，并用含3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。透射电镜观察拍片。对于自噬体的定量分析，每组检查10个随机区域。
1.7 统计学分析数据分析及绘制统计图表均采用GraphPad Prism 6.0统计软件。数据用x±s表示，各组数据先进行正态性和方差齐性检验，采用t检验比较两组之间的差异。
2 结果 2.1 高糖抑制H9c2细胞自噬如Fig 1所示，与对照组相比，高糖组(17、30 mmol·L-1)H9c2细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的表达降低，p62表达升高(P < 0.01)。透射电镜观察细胞自噬体数目显示，与对照组相比，高糖组(17、30 mmol·L-1)自噬小体数目明显减少(P < 0.01)。
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| Fig 1 Autophagy in H9c2 cells inhibited by high glucose (x±s, n=3) A: Expressions of LC3, Beclin-1, and p62 in cardiomyocytes; B: Transmission electron microscopy (scale bar: 2 μm, red arrow indicates autophagosomes). **P < 0.01 vs control. |
通过以上实验，确定高糖浓度30 mmol·L-1用于以下实验。如Fig 2所示，与对照组相比，高糖(30 mmol·L-1)环境中H9c2心肌细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的蛋白表达降低(P < 0.01)，p62表达升高(P < 0.05)；ACh(10-6、10-5、10-4 nmol·L-1)处理，可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1表达，增加p62表达(P < 0.01)。
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| Fig 2 Expressions of LC3, Beclin-1 and p62 in H9c2 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs HG |
Fig 3的MTT结果显示，相比于对照组，高糖组细胞活性降低(P < 0.01)；相比于高糖组，ACh组细胞活性明显增加，且ACh浓度大于10-4 nmol·L-1差异具有统计学意义(P < 0.05)。细胞内ATP含量检测显示，相比于对照组，高糖组细胞内ATP含量明显降低(P < 0.05)；相比于高糖组，ACh组细胞内ATP含量明显增加，且ACh浓度大于10-4 nmol·L-1差异具有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 3 H9c2 cell activity under high glucose increased by ACh (x±s, n=3) A: Relative cell viability in each group; B: Relative ATP content in each group. **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG. |
根据上述细胞活性实验及ATP含量测定，ACh浓度为10-4 nmol·L-1用于以下实验。Fig 4的Western blot结果显示，相比于对照组，高糖组Bax/Bcl-2比值升高(P < 0.01)；相比于高糖组，HG+ACh组及HG+3-MA组Bax/Bcl-2比值均降低(P < 0.01)；相比于HG+ACh组，Ach+Rap组Bax/Bcl-2比值反而升高(P < 0.01)。
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| Fig 4 Expressions of Bax, Bcl-2 in H9c2 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs HG; △△P < 0.01 vs HG+ ACh |
如Fig 5所示，相比于对照组，高糖组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降, p-mTOR/mTOR比值上升(P < 0.01)；相比于高糖组，HG+ACh组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降(P < 0.01)，而p-mTOR/mTOR比值上升(P < 0.01)；相比于HG+Ach组，HG+ACh+AICAR组p-AMPK/AMPK比值上升，而p-mTOR/mTOR比值下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升(P < 0.01)。提示ACh抑制自噬时，伴有p-AMPK/AMPK比值的下降及p-mTOR/mTOR比值的上升，而利用AMPK激活剂AICAR上调AMPK信号通路，可部分上调自噬水平。
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| Fig 5 Expressions of LC3, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR in H9c2 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG; △△P < 0.01 vs HG+ ACh |
在临床上，DCM是一个排除性诊断，不易被诊断，当糖尿病患者出现心血管并发症，并诊断为DCM时，提示患者预后差。大量研究已证实, 糖尿病可影响糖代谢及脂代谢，从脂质毒性、糖毒性、氧化应激增强、线粒体功能失常、炎症、内质网应激等多个方面损伤心肌细胞，导致DCM的发生发展。因此，寻找治疗DCM新的治疗靶点极具意义。有研究表明，自噬参与糖尿病微血管及大血管并发症的发生与进展[2, 9-10]，近年来研究发现，ACh可调控AMPK途径介导的细胞自噬，影响心肌细胞凋亡。本实验成功构建了高糖诱导心肌细胞损伤模型，在细胞水平探究了ACh在其中的作用及机制。
与既往的研究一致[6]，本研究再次证实高糖可抑制心肌细胞自噬，利用自噬抑制剂3-MA抑制自噬水平，发现心肌细胞凋亡水平反而下降，提示高糖抑制细胞自噬对高糖诱导的细胞损伤是一种保护效应。我们的研究发现，ACh可增加高糖状态下心肌细胞活性，并伴随有细胞内ATP含量升高。进一步研究发现，ACh抑制自噬水平，作用类似自噬抑制，ACh处理后抑制心肌细胞自噬，可减少高糖诱导的细胞凋亡，而在ACh处理后再利用Rap处理，反而出现了细胞凋亡的增加。而Zhao等[11]的研究表明，ACh可促进缺氧复氧过程中心肌细胞自噬，减少缺氧复氧造成的心肌损伤。之所以存在ACh既可抑制心肌细胞自噬，也可促进心肌细胞自噬，我们推测其原因可能与建立的细胞损伤模型不同有关。生理状态下，细胞自噬是维持细胞稳态的一种适应性机制，在不同的应激条件下，自噬水平的高低对细胞存活是一把双刃剑。因此，可能存在ACh在不同条件下，以不同的方式调控自噬活性，维持细胞稳态。
在饥饿、缺血、缺氧、氧化应激等营养或能量限制条件下，会诱导自噬水平升高。鉴于葡萄糖剥夺(营养限制条件)能够诱导自噬，高葡萄糖(营养过剩的条件)会抑制心肌细胞中的自噬并不奇怪。自噬可在胰腺β-细胞中保护其免受糖尿病诱导的氧化损伤，因此，可以理解的是，在本研究中抑制的自噬并不会导致高葡萄糖毒性。相反，这种适应性反应构成了在高葡萄糖暴露期间，促进心肌细胞存活的机制的一部分。支持我们的结果有，葡萄糖输注减少了肝脏中的自噬，伴随着脂多糖诱导的全身性炎症的减弱[12]。这些结果强调了一个事实，即自噬可能是保护性的，也可能是有害的，这取决于细胞类型和细胞环境。因此，必须单独确定在不同病理条件下自噬的功能意义。
自噬受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、NF-κB等众多信号转导通路调节，其中mTOR是最重要的一条通路，负向调控自噬活性。PI3K/Akt与AMPK是mTOR上游的两条通路, 且相互密切联系[13]。抑制PI3K/Akt可降低mTOR的活化，从而促进自噬的发生[14]，AMPK与之相反[15]。本研究发现，ACh是通过抑制AMPK，促进mTOR的活化，从而抑制自噬。
自噬在病理状态下作为一种适应性应激来维持整体的平衡，作为细胞应对不良环境的一种防御机制。目前研究最多的是巨自噬。在肿瘤、神经退行性疾病、衰老、心血管疾病、感染等众多疾病的病理生理过程中，自噬都起了重要作用，调控自噬可能成为防治相关疾病潜在靶点之一。本研究发现，ACh可作为干预靶点调节自噬活性，ACh通过抑制自噬，降低高葡萄糖毒性，进一步推测，ACh可能通过自噬途径参与众多疾病的发生、发展。此外，离体细胞模型与体内模型存在差异，因此，本课题组拟在糖尿病心肌病动物模型展开进一步研究。
( 致谢: 本实验在江西省高血压研究所完成，在此感谢张婉老师及曾俊义老师在实验中给予的帮助与支持。)
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