2. 中国生物技术发展中心, 北京 100039
2. China National Center for Biotechnology Development, Beijing 100039, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)属于神经退行性疾病，其主要临床特征为进行性记忆减退和认知功能障碍，影响患者生存生活能力，并导致其精神和行为异常。脑部主要病理学特征为淀粉样斑的堆积、神经元纤维缠结、神经细胞凋亡和突触数量减少等，在疾病发展过程中通常不会出现明显的临床症状。医院确诊的AD病人中，约95%为散发性AD，多为晚发型AD(late-onset Alzheimer’s disease，LOAD)，疾病发展情况受遗传因素与环境因素等多方面影响，其中载脂蛋白E4 (apolipoprotein E4，ApoE4)是高风险因素。而常染色体显性遗传型AD (autosomal dominant inherited Alzheimer’s disease，DIAD)多发病较早，通常与早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)以及淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)有关[1]。
AD的病因尚不明确，相关学说众多。β-淀粉样蛋白(amyloid beta-peptides，Aβ)学说认为，AD患者脑部聚集的Aβ神经毒性强，可引起脑部炎症、细胞凋亡、线粒体功能障碍等一系列效应。以Aβ为靶点的药物主要分为减少Aβ生成、减少Aβ聚合和加速Aβ清除三方面，涉及到β分泌酶抑制剂、γ分泌酶抑制剂、γ分泌酶调节剂、α分泌酶激动剂以及Aβ抗体和Aβ疫苗等[2]。尽管很多围绕Aβ学说展开的临床试验相继以失败告终，但Aβ学说在发病机制的研究中仍占有重要地位。Tau蛋白异常过度磷酸化也是一个重要的学说，其异常磷酸化可影响微管的装配以及稳定性，以Tau蛋白为靶点的药物主要涉及激酶抑制剂，Tau蛋白聚合抑制剂以及微管稳定剂等[2]。以信号通路功能异常为核心的学说认为，AD患者神经系统多种信号通路功能异常，导致神经系统功能紊乱。也有研究表明，高脂血症可加重Aβ对老年AD大鼠神经元的损伤以及Tau蛋白异常过度磷酸化[3]。Reelin属于分泌型糖蛋白，通过与其受体的相互作用，使细胞质衔接蛋白(Disabled-1, Dab1)磷酸化，进而开启下游信号通路，早期主要与皮层形成、神经细胞迁移过程相关，后期起到调节突触功能的作用。近年研究表明，Reelin信号通路可能与AD的发病有密切关系，本文将对Reelin蛋白的结构功能及其所属通路在AD发病机制中的作用进行综述。
1 Reelin的结构和功能Reelin是一种大型的分泌型细胞外基质糖蛋白，由3 641个氨基酸残基组成，人的RELN基因位于7号染色体。SDS-PAGE凝胶电泳显示，Reelin有410 ku、330 ku、180 ku以及数个低分子量条带。Reelin含有信号肽序列，其后是N端序列、铰链区以及八段氨基酸重复序列，以高度碱性的C端序列结束。Reelin在胞外扩散过程中可被切割，位点分别在重复序列2和3(位点N-端)之间，以及在重复序列6和7(位点C-端)之间，完全切割的Reelin可以产生3个片段，N端片段(N端到第2个重复序列)、中央片段(第3~6段重复序列)，以及C端片段(第7段重复序列到C端)。中央区域包含载脂蛋白E受体2 (apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)和极低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptor，VLDLR)的结合位点，N端区域主要和Reelin同源二聚体的形成有关，影响Dab1磷酸化水平[4]。N端区域还和α3β1整合素等一些受体结合相关。另外，C端区域也会影响Reelin磷酸化Dab1的能力。
胚胎时期，Reelin主要由海马和皮质分子层中的Cajal-Retzius(C-R)细胞合成并分泌。大脑发育阶段，Reelin主要通过控制细胞间相互作用，调节神经细胞迁移和定位。在成人大脑中，Reelin分泌水平下降，但依然发挥重要作用，此时的Reelin主要由γ-氨基丁酸能中间神经元分泌，通过提高对长时程增强(long time potentiation，LTP)的诱导效应，来调节突触可塑性。Reelin还可调节树突的生长及成熟、神经递质释放等[5]。Reelin缺陷小鼠(Reelin-deficient mice，reeler)树突分支以及树突棘减少，杂合reeler小鼠(heterozygous reeler mice，HRM)缺失1个RELN等位基因，Reelin表达下调50%，同样出现树突分支以及树突棘轻微减少的情况。但HRM中神经元定位不受影响，表明由Reelin缺陷导致的树突异常与神经元定位异常无关[6]。Reelin对大脑发育至关重要，但ApoER2的另一种配体ApoE缺陷的患者却具有正常的认知功能，这可能与ApoE在小鼠和人类中都在相对较晚时期开始表达有关。另外有研究表明，reeler小鼠大脑中脂肪酸(fatty acid，FA)组分发生变化，为发现Reelin新功能提供了基础[7]。
2 Reelin的受体及下游信号通路Reelin受体包括ApoER2、VLDLR、α3β1整合素等。敲除ApoER2和VLDLR或者Dab1缺失后出现的reeler表型，表明这些分子对于Reelin正常发挥功能的必要性。迁移过程中，ApoER2可能与起始信号相关，VLDLR则和中止信号相关[8]。
ApoER2的选择性剪接对Reelin实现其功能有重要作用。Reelin与ApoER2结合后，ApoER2可被一系列蛋白酶切割，释放可溶性胞外结构域(soluble extracellular domain，ECD)。α分泌酶切割产生的C端片段(C-terminal fragments，CTFs)可被γ分泌酶切割，释放胞内结构域(intracellular domain，ICD)，Reelin可诱导这种切割，ApoER2切割片段可负反馈调节Reelin信号。ApoER2-ECD可以作为ApoER2配体的显性负性受体，ApoER2-ICD可以易位至细胞核并改变基因的转录，降低Reelin mRNA水平。ApoER2的选择性剪接可以影响这一系列的切割[6]。
ApoE4是晚发型AD的主要遗传风险因素。ApoE4与ApoER2结合后，诱导受体降解，并伴随胞内区室中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的螯合[9]。因此，Reelin可竞争性抑制ApoE对NMDAR和ApoER2的占据，维持突触可塑性。ApoER2前mRNA经过选择性剪接可产生两种形式，含有倒数第2节外显子的ApoER2亚型在突触相关信号通路中为有效亚型，而AD病人与转基因AD小鼠中，有效ApoER2亚型比例均降低，利用反义寡核苷酸改变其选择性剪接，增加功能性ApoER2/Reelin复合物的形成，可改善突触功能[10]。
Reelin与受体结合，并启动下游转导信号系统。Dab1聚集并激活酪氨酸激酶Src和Fyn，导致Dab1磷酸化。Dab1磷酸化可激活下游激酶，包括PI3K及Akt，最终导致糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)在其抑制性Ser-9位点磷酸化，从而抑制GSK-3β活化。Reelin信号系统有助于突触形成，通过NMDA受体控制Ca2+进入，从而调节LTP、突触传递和突触可塑性，与记忆、认知功能密切相关。磷酸化的Dab1可以引起无脑回综合症致病基因产物(lissencephaly protein 1，LIS1)聚集，影响微管动力学等。Reelin还可使丝切蛋白(Cofilin，CFL)磷酸化，稳定细胞骨架。
3 Reelin信号转导通路与AD的相关性Reelin信号通路在神经系统发育和维持正常功能中有重要作用，许多神经精神障碍，包括阿尔茨海默病、自闭症、精神分裂症、双相情感障碍、抑郁症等，均有异常的Reelin表达。有研究报道，在reeler大鼠和敲除ApoER2/VLDLR的大鼠脑内，存在高度磷酸化Tau蛋白。AD小鼠模型中，发现淀粉样蛋白与Reelin表达水平及ApoER2免疫活性具有关联性[11]。Reelin信号通路在AD中可起到抑制Aβ的产生、促进Aβ的清除、抑制Tau蛋白的高度磷酸化等作用。改变的Reelin表达被认为可以损害神经元连接性和突触可塑性，最终导致认知缺陷。研究发现，APP/PS1双转基因AD小鼠于6月龄出现淀粉样斑块，AD小鼠中Reelin在淀粉样斑周围聚积形成斑块，而非正常的二聚体形式，并且聚积的斑块随病情的加重而逐渐增加，进而影响Reelin功能的发挥，Reelin的聚集与老年斑的形成可能密切相关，而野生型小鼠极少形成Reelin斑块[12]。
3.1 Reelin与Aβ的相互影响老年斑(senile plaque，SP)是AD发病的一个重要病理特征，主要为葡萄糖多聚物以及Aβ、Tau、APP、α-突触核蛋白等在内的多肽类和蛋白质。Aβ由39~43个氨基酸组成，是AD病人脑中发现的淀粉样斑块的主要成分，APP被β和γ分泌酶切割可产生Aβ，Aβ异常聚集时形成β淀粉样斑块。
Aβ可对Reelin及其所在传导通路造成损伤。Aβ42存在时，Reelin不能形成同源二聚体的活性形式，AD患者大脑中的Reelin提取物中含有很多高分子团块，激活ApoER2的能力下降[13]，年龄相仿的对照组中则具有活性的同源二聚体。Aβ影响Reelin活性，并改变其表达的具体机制仍需研究。另外，Reelin的表达变化情况在AD患者中有较大的差异，有报道称，这种差异与ApoE4基因相关[14]，处于Braak stage晚期且不携带ApoE4基因的AD患者，Reelin mRNA水平明显增加，ApoER2-CTF的水平明显降低，而携带ApoE4基因患者中并未发现这一改变。推测Aβ通过抑制ApoER2，增加Reelin表达，为机体的一种自调节机制。在Aβ存在时，Reelin以一种高水平却无效的形式存在，即病理状态下，Reelin信号通路和自我调节机制的失效，而ApoE4携带者可能有着不同的Reelin-CTFs平衡。
内嗅皮质是AD最先发生病变的地方。有研究证实，在内嗅皮质2层中，细胞内Aβ选择性在Reelin免疫反应性细胞内表达，与Reelin明显共同定位于细胞内，提示Reelin和Aβ的结构相关性。Reelin可与可溶性Aβ42相互作用，从而延缓Aβ纤维形成和募集[15]。Reelin蛋白表达减少的AD小鼠，则表现出增多的淀粉样斑块。
与Reelin相反，Aβ寡聚体在突触后具有拮抗作用，Aβ结合受体后，激活钙调神经磷酸酶(calcineurin，PP2B)，PP2B调节纹状体富集的蛋白酪氨酸磷酸酶(striatal-enriched protein tyrosine phosphatase，STEP)的表达水平和活性。STEP的某些靶标同样是Reelin-ApoER2信号通路中被磷酸化的NMDAR酪氨酸残基。因此，Aβ介导的STEP激活可导致NMDAR过度内化，Aβ还可通过信号级联反应激活GSK-3β[16]。
有研究发现，在没有产生淀粉样蛋白病理学的情况下，缺乏Reelin和ApoE受体信号传导通路的成年小鼠表现出较好的耐受性，这可能是由于稳态调节和其他神经调节机制的补偿。Reelin通过复杂的信号级联反应来保护突触免受Aβ的损害作用，以维持激酶和磷酸酶活性的平衡。已经发现，在成人阶段丢失Reelin并没有引起明显的认知障碍，这表明健康的中枢神经系统能够平衡补偿Reelin的损失。然而，在Reelin缺陷型小鼠中，Aβ的过度表达使其在Morris水迷宫学习任务中表现出严重的学习、记忆损害[17]。
3.2 Reelin对Tau蛋白的影响微管系统是微管蛋白及微管相关蛋白组成的神经细胞骨架成分，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常Tau蛋白含2~3个磷酸基，与微管蛋白结合，促进其聚合形成微管，维持微管稳定性。而AD患者脑内，每分子Tau蛋白磷酸基可达到5~9个，异常过度磷酸化使其无法发挥正常功能。
在Reelin的转导通路中，Reelin与受体结合，使Dab1磷酸化，通过一系列级联反应抑制GSK-3β活性, 而GSK-3β通常使Tau蛋白磷酸化，故Reelin在一定程度上抑制Tau蛋白磷酸化，Reelin表达的减少会导致Tau蛋白磷酸化增加、神经纤维缠结增加[18]。Reelin杂合敲除和ApoE4敲入小鼠均显示Tau磷酸化水平升高。
细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)可使Tau磷酸化，且不依赖于Reelin信号通路，CDK5也参与鼠脑发育过程中皮层神经元的定位过程，表明Reelin信号通路和CDK5级联反应之间重叠性。
3.3 Reelin信号通路对突触的影响AD患者的海马和皮层突触功能紊乱，导致早期的记忆、认知损伤。Reelin信号通路对于突触数量以及功能有重要作用，影响突触可塑性。LTP是突触可塑性的一种形式，可被高频刺激所诱导，使突触有效性增加。Reelin处理海马切片时，LTP增加[19]，VLDLR和ApoER2敲除小鼠没有出现这一现象。研究发现，VLDLR敲除小鼠中高频刺激诱导的LTP减少，ApoER2受损的小鼠中迟发性LTP明显延迟。Reelin可参与空间和恐惧方面的记忆形成，通过向小鼠脑室内注射Reelin可以改善学习和记忆[20]。相比于野生型，HRM和reeler小鼠海马神经元树突棘减少，并且其减少程度与Reelin蛋白丢失的量有比例关系，而外源性Reelin可以改善这一现象[21]。
Reelin通路可对突触组分起到调节作用。突触从发育到成熟的过程中，海马突触中NMDA受体的主要组分会发生从NR2B亚单位到NR2A亚单位的改变，使用外源性Reelin处理培养的海马神经元可加速这一过程，敲减Reelin可抑制这个过程[22]。
大量研究表明，Reelin信号通路可通过NMDA受体调节Ca2+内流，增加LTP，影响突触传递、突触可塑性以及突触的形成[23]。Reelin还可增加活性调节型细胞骨架蛋白(activity-regulated cytoskeletal，Arc)mRNA的翻译，巩固LTP。NMDA受体在AD早期已出现变化，Aβ的异常聚集影响突触功能，将海马神经元与Aβ寡聚体共培育，会导致AMPA、NMDA型谷氨酸受体功能以及LTP受损[24]。应用Reelin可一定程度上逆转这一现象，Reelin可拮抗Aβ对突触功能的影响。
4 靶向Reelin的临床研究目前，关于Reelin的研究多处于临床前阶段，进入临床阶段的实验较少。RELN (rs7341475G)是一个与女性精神分裂症风险相关的单核酸多态位点，围绕此位点展开的临床试验表明，此位点对实验中检测的精神分裂症相关指标未发现明显影响[25]。
5 小结Reelin在发育阶段以及完成神经迁移后的成熟脑内，均发挥着举足轻重的作用。目前已经发现Reelin与多种神经精神疾病相关，其中，Reelin蛋白及所在通路与AD的发病密切相关，在AD疾病进展过程中，Reelin信号通路受到不同程度的损伤。此外，Reelin具有神经保护作用，可抵抗Aβ造成的神经毒性，抑制Tau蛋白过度磷酸化，调节突触可塑性与LTP。因此，提示Reelin可能成为AD预防和治疗的潜在靶点。但Reelin蛋白在AD发病机制中的作用，以及干预Reelin蛋白后AD病理改变的转归，仍需要进一步深入研究。
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