2. 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州 贵阳 550004;
3. 黔东南民族职业技术学院医药技术系，贵州 凯里 556000
2. Experimental Center of Stem Cell and Tissue Engineering, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China;
3. Qiandongnan Vocational and Technical College for Nationalities, Kaili Guizhou 556000, China
砷及其化合物具有毒性，在我国一些地区严重超标，经人体摄入后，易引起急、慢性砷中毒，造成肝脏、心脏、肾脏或皮肤等器官或组织损伤[1]。研究显示，神经细胞难以再生，且对毒性物质更加敏感，因而砷暴露时间过长将损伤神经系统[2-3]。因此，如何有效预防和治疗砷中毒显得尤为重要。3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST或3-MST)由297个氨基酸组成，定位于细胞质。MPST以单体或二硫键连接的同型二聚体存在，其功能是催化硫离子的转移，使硫离子结合硫醇化合物(如氰化物)，进而参与氰化物解毒和半胱氨酸降解[4]。本课题组前期研究显示，亚砷酸钠(sodium arsenite，NaAsO2)可抑制PC-12和SH-SY5Y神经细胞生长，下调MPST蛋白表达[5-6]。因此，本研究采用SH-SY5Y细胞为研究对象，外源性过表达MPST蛋白，观察其在NaAsO2干预神经细胞生长周期中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，购自德国DSMZ公司。
1.1.2 试剂胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青公司；青霉素-链霉素和胰蛋白酶，购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)和结晶紫染液，购自北京索莱宝公司；DMEM培养基，购自美国HyClone公司；NaAsO2，购自美国Sigma公司；CCK-8溶液，购自日本同仁；PI单染细胞周期检测试剂盒，购自南京凯基；抑癌基因p53蛋白抗体、细胞周期调控因子CDC25A抗体、细胞周期蛋白A(cell cycle protein A，CyclinA)抗体、周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)抗体、MPST抗体、抗小鼠IgG-HRP二抗，购自美国Santa Cruz公司。
1.1.3 仪器Model 310细胞恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；细胞培养超净台(苏州净化)；全波段多功能酶标仪(BioTek公司)；Eclipse Ti-s倒置显微镜(日本Nikon公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；全自动凝胶成像仪(美国SynGene)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养SH-SY5Y细胞培养在高糖DMEM培养基(含10% FBS和1%青霉素-链霉素)中，培养于37 ℃、5% CO2的培养箱中，隔天换液，细胞生长至70%汇合度时进行传代或冻存。
1.2.2 慢病毒转染MPST过表达经PCR扩增、双酶切、连接目的片段与载体、挑选阳性克隆、测序验证，扩增培养阳性菌落，而后鉴定和抽提质粒。慢病毒包装MPST质粒和空载体，收集病毒并测定滴度。SH-SY5Y细胞在12孔板生长至50%汇合度时进行转染，细胞更换为含10 mg·L-1基因转染增强剂聚凝胺(polybrene)及10% FBS的DMEM培养基，分别于不同孔加入1 mL含MPST和空载体的病毒液，分别设为过表达组和空载对照组，培养箱中继续培养6 h后，更换含10% FBS的DMEM培养基继续培养，细胞生长至90%汇合度时，以嘌呤霉素进行筛选，最终以蛋白印迹实验验证MPST表达水平。
1.2.3 组别设置实验组别分别为：慢病毒转染的过表达组(overexpression group)，简称OP组；空载对照组(no-load control group)，简称NC组；同时以正常模型细胞设立空白组(blank control group)，简称BC组。
1.2.4 CCK-8法检测取对数期模型细胞，以每孔8×103个铺于96孔板中，培养过夜，设6个NaAsO2浓度梯度(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)，每组5个复孔，同时设置调零孔和对照孔。放入培养箱继续培养，分别于24、48 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，继续培养3 h，酶标仪测定OD值(450 nm)，计算细胞活力。细胞活力=[(NaAsO2处理孔OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)]×100%。
取对数期BC、NC和OP组细胞，分别以每孔8×103个铺于96孔板中，培养过夜，每组设5个复孔，以含50 μmol·L-1 NaAsO2的DMEM培养基处理上述3组细胞，同时设置调零孔及以BC细胞设置空白对照组，48 h后按上述方法继续操作。
1.2.5 结晶紫染色选择对数期BC、NC和OP组细胞接种于6孔板，培养箱培养至汇合度达到60%~70%时，细胞同步化12 h，然后以含50 μmol·L-1 NaAsO2的DMEM培养基处理上述3组细胞，继续无血清培养。24 h后结晶紫染色，细胞PBS洗3遍，每孔2 mL 4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗掉固定液后，双蒸水洗2遍，每遍1 min，加入2 mL结晶紫染色10 min，双蒸水洗涤后拍照，每组取拍照图3~5张，人工计数后进行图片和统计学处理。设BC组细胞贴壁存活率为100%，细胞贴壁存活率=(NaAsO2处理组细胞数/BC组细胞数)×100%。
1.2.6 细胞周期检测取对数期BC、NC和OP组细胞铺于6孔板中(5×109·L-1)，培养过夜，以含50 μmol·L-1 NaAsO2的DMEM培养基处理上述3组细胞，同时以无NaAsO2的DMEM培养BC细胞作为空白对照，48 h后以不含EDTA的胰酶消化细胞，1 528×g离心5 min，PBS洗2次，70%乙醇于4 ℃冰箱固定30 min，1 528×g离心5 min，PBS洗2次，1 528×g离心5 min，弃PBS，加入300 μL PI/RNase染色工作液，室温避光60 min，加入样品管中，用流式细胞仪在488 nm激发光处检测。
1.2.7 蛋白印迹检测药物处理细胞后，以RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L-1 PMSF)裂解细胞，冰上裂解10 min，20 627×g离心15 min，取上清液进行BCA蛋白定量，计算并配制上样缓冲液，100 ℃变性5 min，进行12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2 h，用p53、CDC25A、CyclinA、CDK2抗体(1 :1 000)或内参抗体GAPDH(1 :2 000)于4 ℃摇床孵育过夜，PBS洗膜3次，抗小鼠IgG-HRP二抗室温孵育1 h，PBS洗膜3次，PVDF膜以化学发光试剂盒显色，凝胶成像仪成像，以Quantity One对蛋白印迹条带处理和分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行分析处理。数据以x±s表示，组内两样本均数比较用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 NaAsO2和MPST对细胞活力的影响如Fig 1B所示，NaAsO2(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)分别处理模型细胞24、48 h，48 h时NaAsO2对模型细胞的IC50为50 μmol·L-1。蛋白印迹实验发现(Fig 1A)，BC和NC组MPST蛋白表达无明显差异；而与NC组相比，OP组MPST蛋白表达明显升高(P＜0.01)。以NaAsO2(50 μmol·L-1)处理3组细胞48 h，结果显示(Fig 1C)，BC和NC组细胞存活率明显降低(P＜0.01)；BC和NC组间细胞存活率无明显差异；而与NC组相比，OP组细胞存活率明显升高(P＜0.01)。
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| Fig 1 Effects of NaAsO2 and MPST over-expression on cell viability of SH-SY5Y cells(x±s, n=3) A:MPST protein expression level; B:Effects of different concentrations of NaAsO2 on the viability of model cells; C:Effect of NaAsO2 on the viability of cells in each group. **P < 0.01 vs NC; ##P < 0.01 vs BC alone. |
如Fig 2所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)处理48 h，BC和NC组细胞贴壁力明显降低(P＜0.01)，BC和NC组细胞贴壁存活率无明显差异；与NC组相比，OP组细胞贴壁存活率明显回升(P＜0.01)。
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| Fig 2 Effect of MPST over-expression on cell adherence viability of NaAsO2 inhibition model(x±s, n=3) A:Effect of NaAsO2 on the viability of adherent cells in each group; B:Adherence survival rate. **P < 0.01 vs NC; ##P < 0.01 vs BC alone. |
如Fig 3、Tab 1所示，NC加药组和BC加药组细胞周期无明显差异，与空白组相比，给予NaAsO2(50 μmol·L-1)处理48h后，BC和NC组细胞S期比例明显增加(P＜0.01)；而与NC组相比，OP组细胞S期比例明显减少(P＜0.05)。
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| Fig 3 Cell cycle changes in each group A:BC group; B:OP group; C:Treatment of BC group with NaAsO2; D:Treatment of NC group with NaAsO2; E:Treatment of OP group with NaAsO2. |
| Group | G1 | S | G2 |
| BC | 81.56±10.28 | 10.20±3.88 | 8.24±3.15 |
| OP | 82.30±13.33 | 10.28±3.26 | 7.42±2.88 |
| BC+NaAsO2 | 53.22±9.19 | 39.32±8.85## | 7.46±3.65 |
| NC+NaAsO2 | 51.10±11.22 | 39.59±9.52## | 9.31±5.58 |
| OP+NaAsO2 | 73.19±13.02 | 18.75±5.65* | 8.06±4.35 |
| ## P＜0.01 vs BC; * P＜0.05 vs NC+NaAsO2 | |||
如Fig 4所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)处理48 h，BC和NC组细胞p53蛋白明显上调，CDC25A、CyclinA及CDK2蛋白明显下调(P＜0.01)；BC和NC组细胞各蛋白表达无明显差异；与NC组相比，OP组细胞上述改变明显被拮抗(P < 0.05, P＜0.01)。
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| Fig 4 Changes of p53, CDC25A, CyclinA and CDK2 protein expression in different groups(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC; ##P < 0.01 vs BC alone |
环境中的砷一般以无机砷化物的形式存在，如NaAsO2、三氧化二砷、砷酸盐等，长期暴露于无机砷化物环境中可引起神经系统损伤、心血管疾病、泌尿系统等疾病[7]。砷进入血液后可通过血脑屏障进入大脑，进而损伤神经系统。研究表明[8]，NaAsO2可诱导神经细胞凋亡，抑制细胞骨架形成，破坏细胞正常结构。
前期工作表明[5]，NaAsO2可抑制SH-SY5Y细胞生长。而本研究发现，MPST过表达能明显抑制NaAsO2导致的细胞活力和贴壁能力下降的效应。有报道，NaAsO2或三氧化二砷能诱导人正常肝细胞G2/M期阻滞、生长抑制[9]。本研究也发现，NaAsO2明显诱导SH-SY5Y细胞S期阻滞，而过表达MPST可减轻NaAsO2对S期的阻滞效应。这些结果提示，MPST过表达所发挥的保护效应可能与降低细胞S期阻滞有关。
为了探讨MPST对细胞S期相关蛋白的影响，我们进一步观察了p53、CDC25A、CyclinA及CDK2等S期相关蛋白的表达情况。研究发现，经NaAsO2处理后，SH-SY5Y细胞CyclinA、CDK2及CDC25A明显下调，p53明显上调；而过表达MPST可拮抗NaAsO2对CyclinA、CDK2、CDC25A及p53的作用。
CyclinA-CDK2是细胞S期主要的复合物，能启动DNA的复制[10-11]。据报道，阿霉素诱导肝癌细胞HepG2 S期阻滞，伴随CyclinA、CDK2及CDC25A表达下调[12]。有研究报道，miR-155可通过上调p53蛋白表达，诱导前列腺癌细胞周期阻滞[13]。在本研究中，NaAsO2可能通过上调p53，下调CyclinA、CDK2、CDC25A蛋白表达，诱导SH-SY5Y细胞S期阻滞；过表达MPST通过调节S期相关蛋白表达，发挥对NaAsO2毒性损伤的拮抗效应。
硫化氢对化学性神经细胞损伤具有保护作用，而MPST是硫化氢的内源性合成酶[4, 14]。因此，外源性过表达MPST增加了内源性硫化氢，进一步拮抗砷造成的细胞S期阻滞，从而发挥对神经细胞的保护效应。本实验将为临床神经性砷中毒的防治提供一定的实验依据。
( 致谢: 本实验在贵州医科大学生理学教研室实验室完成，感谢所有老师和同学对本课题研究给予悉心指导和帮助。)
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