2. 南昌大学基础医学院生理学教研室，江西 南昌 330006;
3. 南昌大学第二临床医学院，江西 南昌 330019;
4. 江西省口腔生物学重点实验室，江西 南昌 330019
2. Basic Medical College of Nanchang University, Nanchang 330006, China;
3. Second School of Clinical Medicine of Nanchang University, Nanchang 330019, China;
4. the Key Lab of Oral Biomedicine of Jiangxi Province, Nanchang 330019, China
三叉神经痛(trigeminal neuralgia，TN)是三叉神经分布区域受到某些触觉刺激，如咀嚼、说话、微笑、洗脸、剃毛、刷牙等，引发的剧烈疼痛。有时可伴有面部的痛性痉挛[1]。通常TN常见于中老年女性，估计年发病率在每10万人中有4~13人。据统计，TN更易发生在右侧面部，严重影响患者的生活质量[2]。
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)是神经生长因子家族成员之一。BDNF高亲和力受体TrkB目前已被证实与神经元的存活、突触的可塑性和完整性密切相关[3]。BDNF/TrkB通路在神经退行性变中表达减低[4-5]，通过给予相应药物，增加BDNF表达，以改善抑郁、焦虑、学习记忆障碍等[6]。近年来，对BDNF与慢性疼痛的研究日益深入。有学者报道，坐骨神经痛模型中，某些炎症因子可促进BDNF/TrkB表达增加，进而使机械痛缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)降低[7]。在口腔颌面部疼痛，如急慢性牙髓炎[8]、带状孢疹引起[9]的神经性疼痛中，三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)的BDNF分泌增加。上述研究均证实，BDNF与慢性疼痛密切相关。但在TN的TG中，BDNF及其受体TrkB的表达变化及可能机制的报道较少。本研究采用眶下神经慢性损伤压迫模型(infraorbital nerve chronic injury compression model, ION-CCI)制备TN大鼠动物模型，观察TN大鼠TG中BDNF及其受体TrkB的表达变化，旨在明确BDNF及其受体TrkB是否促进TN的痛觉传递。
1 材料 1.1 实验动物SD成年♂大鼠，体质量(180~220) g，购自江西中医药大学实验动物科学部，动物许可证号：SCX(赣)2018-0003。大鼠随机分为假手术组(Sham)和TN模型组，在实验开始前3 d使大鼠适应实验环境。在光照周期(12 h :12 h)中，在一天的同一时间(9 :00~14 :00)测试所有动物。
1.2 试剂BDNF及TrkB抗体(美国Abcam公司)；q-PCR实验所需引物，购自上海生工；DAB试剂盒、SP-9001试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Triton X-100(Solarbio公司)；RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)；山羊抗小鼠FITC、山羊抗兔TRITC(EarthOx公司)；RNA逆转录试剂盒(Trans Gen公司)；抗荧光衰减封片剂(上海经科化学科技有限公司)。
1.3 仪器BME-403 Von Frey(中国医学科学院生物医学研究所)；Step one plus实时荧光定量PCR仪(美国Life)；冰冻切片机(德国徕卡公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；电热恒温水浴锅(上海医用恒温设备厂)。
2 方法 2.1 TN模型的建立根据本课题组前期实验，TN模型按如下方法建立：SD大鼠按3 mL·kg-1腹腔注射100 g·L-1水合氯醛, 待麻醉后，剃除大鼠右侧面部触须及毛发，13.12 μmol·L-1酒精消毒术区，于大鼠眶下缘约3~4 mm, 紧贴鼻根处，沿鼻骨方向长约3~5 mm切口，用4-0铬制羊肠线松松接扎眶下神经，共2道，相隔至少约1 mm。假手术组仅暴露右侧眶下神经，但不接扎，其余所有操作同TN组。手术过程中，所用物品均高压灭菌。术后常规饲养。
2.2 机械性痛阈的测定各组大鼠分别在术前3、2、1 d行机械刺激适应，术后d 1开始，每隔1 d用电子测痛仪刺激眶下神经分布区域。每只大鼠刺激6次，间隔1 min。出现以下行为中任意1项则认为是有效刺激, 该刺激强度即为疼痛阈值[10]：(1)非对称性面部搔抓；(2)攻击行为；(3)躲避刺激物。
2.3 实时荧光定量PCR(qPCR)检测术后d 14，大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，取手术侧TG，于RNA保存液中，置于-80 ℃保存。待用时，将组织取出，根据试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度后逆转录为cDNA，置于-20 ℃备用。引物序列见Tab 1。qPCR反应条件为95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。通过熔解曲线确定扩增的特异性，以β-actin为内参，计算相应组mRNA表达量。
| Gene | Sequence (5′-3′) |
| BDNF | F:GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC |
| R:TGGACAGCCACTTTGTTTCA | |
| TrkB | F:CGTAGGGACACGCACTCTGA |
| R:CCCAAGACCAGCAAGCATAA | |
| IL-1β | F:CCTATGTCTTGCCCGTGGAG |
| R:ACTGCTGGACGATCACACAC | |
| TNF-α | F:CACGTCGTAGCAAACCACCAA |
| R:TACCTAGAGTTTCTGTTGGTTG | |
| β-actin | F:AAGATCCTGACCGAGCGTGG |
| R:CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG |
术后14 d，麻醉大鼠后，对大鼠进行经心尖灌注，灌注完成后，取右侧TG，4%多聚甲醛4 ℃固定过夜。0.3 g·L-1的蔗糖对组织脱水24 h，每8 h换液，4 ℃过夜。冰冻切片机将组织切成厚8 μm，室温过夜后，放置-20 ℃冰箱。取切片，置内源性过氧化氢酶阻断剂作用10 min，3 mL·L-1 Triton X-100作用10 min, 进口山羊工作血清37 ℃水浴孵育40 min，一抗(BDNF 1 :25，TrkB 1 :100)4 ℃孵育过夜。次日，经PBS冲洗后，37 ℃水浴孵育SP试剂盒B液40 min, 以上各步骤之间用PBS(0.01 mmol·L-1)冲洗5 min×3次, DAB试剂染色，滴加PBS，终止反应，不同浓度乙醇脱水，新鲜二甲苯透明，中性树胶封片剂封片。倒置显微镜下拍照，保存并分析反应密度。
2.5 免疫荧光双标检测术后14 d，取右侧TG冰冻切片，平衡室温后，山羊血清封闭1 h，反应温度为37 ℃。滤纸拭干多余封闭液，加入一抗BDNF(1 :500)、神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein, NeuN)(1 :200)、TrkB(1 :1 000)4 ℃孵育过夜。次日，室温放置0.5 h后，避光加入荧光二抗(FITC、TRITC均为1 :200)37 ℃恒温水浴1 h，以上各步骤之间都需0.01 mmol·L-1缓冲液冲洗，每次10 min×3次。抗荧光衰减剂封片。显微镜下拍照，分析结果。
2.6 统计学分析SPSS 11.5软件对实验结果差异进行两组间t检验，实验数据以x±s表示。
3 结果 3.1 行为学观察术后14 d内，对各组每只大鼠行机械性痛敏检测。如Fig 1所示，TN组大鼠较假手术组手术侧面部机械痛敏阈值明显下降(P＜0.01)。术后d 1, TN组大鼠较假手术组大鼠机械阈值明显降低。
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| Fig 1 Changes of mechanical withdrawal threshold after ION-CCI(x±s, n=12) **P < 0.01 vs sham |
如Fig 2所示，术后d 14，与假手术组比较，TN组大鼠右侧TG中BDNF、TrkB、IL-1β、TNF-α mRNA表达明显增加(P< 0.01 。
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| Fig 2 Relative mRNA expression in TGs of each group detected by qPCR(x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs shams |
术后14 d, 采用免疫组化方法测量TG中BDNF、TrkB的表达。如Fig 3所示，与假手术组相比，TN组中BDNF及TrkB的表达水平明显升高(P＜0.05)。
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| Fig 3 Expression of relative protein in TGs of each group tested by immunohistochemistry(x±s, n=6) Arrows indicate the immunostaining neurons. Scale bar:50 μm. *P < 0.05 vs sham. |
术后d 14，采用免疫荧光双标的方法检测TG中BDNF、TrkB分别与NeuN共表达的情况。Fig 4结果显示，TG中BDNF、TrkB与NeuN共同表达于神经元；与假手术组相比，TN组中BDNF及TrkB表达明显增加。
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| Fig 4 The double-labeled expression in TGs of each group by immunofluorescence(x±s, n=6) Arrows indicate the immunostaining neurons. Scale bar:50 μm. *P < 0.05 vs sham. |
目前，TN的发病原因仍不明确，但被广泛接受的是神经血管压迫学说[11]。除此之外，三叉神经根周围结构解剖异常、动静脉畸形或肿瘤中枢脑干功能障碍也可引起TN[12]。现TN的治疗可分为药物治疗及非药物治疗，但都有不同弊端。因此，对TN的发病机制及分子变化的研究显得极其重要。如前所述，目前大量研究均证实，BDNF与慢性疼痛密切相关，可能影响TG对颌面部疼痛的传递[7-8]。但在TN的TG中BDNF及其受体TrkB的表达变化及可能机制的报道较少，值得进一步深入研究。因此，本实验采用TN动物模型，观察TG中BDNF及其受体TrkB的表达变化。
目前没有完全符合临床表现的理想TN动物模型，Vos等[13]采用ION-CCI建立了TN动物模型，该模型简单、易操作，能较好地模拟临床三叉神经受压引起的痛觉超敏现象，对TN的研究有很大帮助。本实验通过采用ION-CCI建立TN动物模型，术后14 d内，TN组较假手术组机械痛敏值明显降低，说明TN动物模型制备成功。应用qPCR、免疫组化及免疫荧光双标方法检测，结果显示，TN大鼠手术侧TG中BDNF、TrkB mRNA及蛋白水平较假手术组明显升高，且BDNF、TrkB与NeuN共同表达。我们推测，结扎大鼠眶下神经可能使TG过度合成和释放BDNF，促进了局部BDNF浓度升高，导致了TrkB的异常表达升高，促进了痛觉传递。
与此同时，与假手术组相比，TN组中的促炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显升高。有报道，采用慢性压迫坐骨神经制备神经病理痛大鼠模型发现，脊髓背角中BDNF、IL-1β和TNF-α表达水平升高，促进痛觉的传递[14]。因此，我们推测，在TN状态下，TG的BDNF、TrkB表达增强和局部的炎症因子水平升高有一定的关系，有可能存在相互促进升高，加重痛觉过敏的作用。BDNF及其受体TrkB有可能是TN治疗的有效靶点。
总之，TN的病因繁多，病理表现错综复杂，仍需对其发病机制进一步研究，以寻找更安全有效的治疗方法。
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