2. 锦州医科大学辽宁省神经退行性疾病重点实验室，辽宁 锦州 121000;
3. 锦州医科大学基础医学院神经生物学教研室，辽宁 锦州 121000
2. Jinzhou Medical University, Key Lab of Neurodegenerative Diseases of Liaoning Province, Jinzhou Liaoning 121000, China;
3. Dept of Neurobiology, Basic Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning 121000, China
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种常见的，以记忆力进行性减退、认知功能障碍、精神收稿日期:2018-10-20, 修回日期:2018-12-20作者简介：刘亭(1989-)，女，硕士生，研究方向：神经系统疾病，E-mail：398597009@qq.com；隋汝波(1971-)，男，博士，主任医师，博士生导师，研究方向：神经系统疾病，通讯作者，E-mail：1504123943@qq.com及行为活动异常为主要特征的慢性神经退行性疾病。在AD的早期研究中，很少有人会全面关注小脑的变化，可能是由于小脑长期以来被认为仅在协调自主运动和学习方面发挥主要的作用，再加上最初的小脑在细胞和分子水平不受累假说[1]。然而，越来越多的证据表明，在AD患者和AD动物模型中，小脑中也会出现Aβ淀粉样蛋白的沉积和神经原纤维缠结[2]，但有关神经元丢失和其他结构性变化报道较少[3]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要由细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-MAPK三条信号转导途径组成。脑内MAPK/ERK通路可传导细胞膜上的受体信号到细胞核内，参与调节神经元的增殖、凋亡等，与学习记忆能力联系紧密，且与AD的病理机制密切相关[4]。在AD中，此信号通路参与到Aβ依赖的神经毒性作用中，纤维状Aβ引起ERK1/2的激活，持续的激活又引起Tau蛋白的异常磷酸化，神经进行性的退行性变及细胞死亡[5]。
褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，参与各种生理功能，对生物的昼夜节律、性成熟及生殖、衰老、免疫反应、肿瘤、氧化应激等均有调节作用。近年来，对于MT的研究领域颇为广泛，其作为一种抗氧化和神经保护因子，在神经退行性疾病中发挥着重要作用[6]。研究表明，MT通过调节多种信号通路如Notch1和Reelin[7-8]，分别在AD的海马和皮层中发挥其神经保护作用。然而，MT对AD神经保护作用的细胞机制研究仍然缺乏。有研究表明，在脑缺血/再灌注模型中，MT通过MEK/ERK1/2通路提供神经保护作用[9]。本研究将进一步探讨MT是否通过MAPK/ERK通路，在AD中发挥对小脑的保护作用，为MT应用于临床提供一定的理论参考。
1 材料 1.1 实验动物SPF级8周龄SD♂大鼠32只，体质量(220~260) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCKY(京)2012-0001，批号：11400700058126。将动物分组饲养在12 h光照/黑暗循环和温控室中，并在开始实验前适应1周。
1.2 药物与试剂Aβ1-42(批号：A9810)、MT(批号：M5250)、GAPDH抗体(货号：G9545)，均购自美国Sigma公司；HE染色试剂盒，上海碧云天生物技术公司；NeuN(货号：MAB377)，美国Millipore公司；Calbindin(货号：108404)，美国Abcam公司；p-p44/42 MAPK(p-ERK1/2, 货号：4370)、p44/42 MAPK(ERK1/2, 货号：4696)，均购自美国Cell Signaling公司。
1.3 仪器VT1200S振动切片机、4000b倒置显微镜(德国Leica公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；BioSpectrum 510全自动荧光和化学发光成像分析系统(美国UVP公司)；迷你台式真空泵(中国其林贝尔公司)。
2 方法 2.1 药物储存液的配制参考文献[8]，将Aβ1-42肽以200 μmol·L-1溶解于无菌双蒸水(DDW)中，并在37 ℃孵育24 h。以14 000 r·min-1、4 ℃离心10 min后，将可溶性Aβ1-42寡聚体立即储存在4 ℃，并在24 h内使用。在脑室内(i.c.v.)显微注射前，将Aβ1-42的储备液在DDW中稀释至终浓度80 μmol·L-1。将MT溶解于无水乙醇中，制备0.1 mol·L-1储存溶液，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)进一步稀释至25 mmol·L-1用于腹膜内(i.p.)注射。
2.2 实验动物分组及动物模型的制备参考文献[7]，用10%水合氯醛(300 mg·kg-1，i.p.)深度麻醉后，将大鼠置于立体定位仪中。切开的区域用75%乙醇消毒，并在颅骨左侧钻1个孔。根据Paxinos和Franklin(2000)的图谱，将单管微量给药导管(62001，中国瑞沃德)插入左侧侧脑室(坐标：Bregma：AP=-0.7 mm，ML=+1.7 mm，DV=-4.0 mm)[10]。使用牙科水泥将其固定在颅骨，插入导管帽进行密封，药物注射时插入注射内管。术后3 d，将大鼠随机分为4组：对照组、Aβ1-42侧脑室注射组(AD)、MT腹腔注射组(MT)、Aβ1-42侧脑室注射结合MT腹腔注射组(AD+MT)。连续16 d，每天的13 : 30~16 : 00对MT组和AD+MT组腹腔注射1~2 mL的30 mg·kg-1 MT，对照组腹腔注射PBS配制的25%乙醇。腹腔注射完成后，每隔1 d对AD组和AD+MT组给予5 μL的80 μmol·L-1 Aβ1-42侧脑室注射，同时对照组给予5 μL无菌DDW侧脑室注射，共计8 d。手术动物常规术后处理，对所有动物保持室温24 ℃，保证食物、水的充足。d 8开始进行水迷宫行为学实验，检测不同处理组动物的学习、记忆功能，结果见文献[8]。行为学实验结束后，动物小脑组织取材。
2.3 组织切片的制备每组中任选3只大鼠，10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛缓冲液灌流，完成固定及后固定48 h以上，大脑经30%蔗糖沉降48 h后，用振动切片机制备30 μm脑组织切片，置于含1%叠氮钠的PBS缓冲液中，4 ℃保存，用于HE染色和免疫荧光染色。
2.4 HE染色30 μm的组织切片贴于载玻片上，晾干后进行HE染色，光镜下观察小脑皮层的组织结构改变。
2.5 免疫荧光染色检测各组颗粒细胞标记物NeuN、浦肯野细胞标记物Calbindin和p-ERK1/2蛋白表达情况30 μm的组织切片用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，TBS洗3遍，每次5 min。再用3% NDS+0.3% Triton X-100(用TBS稀释)封闭，4 ℃孵育1 h，然后用3% NDS+0.3% Tween-20(用TBS稀释)配制杂交液稀释抗体，一抗NeuN(1 : 1 000)、Calbindin(1 : 1 000)、p-ERK1/2(1 : 800)，4 ℃孵育过夜。次日TBS洗3次后，加入二抗工作液(0.5%驴抗兔/鼠抗体+1.5% NDS，用TBS稀释)，室温孵育1 h，TBS洗3次，加入0.3% H2O2溶液，室温孵育30 min。TBS洗3次。加入ABC液，室温孵育90 min。TBS洗3次。滴加Cy3工作液(TSA buffer稀释50倍)，迅速盖上盖玻片，室温避光孵育10 min。洗去盖玻片，TBS洗3次。DAPI复染10 min。TBS洗3次，晾干。封片后，显微镜下观察、照相及分析。
2.6 Western blot检测各组ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达各组造模完成后，分别任选3只大鼠麻醉后直接断头解剖，收集小脑组织于EP管中，提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，制作样品。抽提好的蛋白样品进行SDA-PAGE电泳，电泳完成后，将凝胶上蛋白质转移到PVDF膜上，350 mA电流转膜90 min。1% BSA封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜, 复温、漂洗一抗，然后37 ℃孵育二抗2 h, TBST漂洗后，ECL发光试剂显影，分析各组p-ERK/ERK的表达情况。
2.7 统计学分析采用ImageJ软件进行图像数据的采集，采用SPSS 17.0建立数据库进行统计学分析，结果表示为x±s。数据分析比较均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用最小显著差值法(LSD)。
3 结果 3.1 各组大鼠小脑皮层病理学变化如Fig 1所示，与对照组相比，AD组分子层(molecular layer，ML)变薄，颗粒细胞层(granule cell layer，GCL)细胞数减少。而AD+MT组分子层并未出现明显的萎缩变薄，颗粒细胞层的细胞数也未出现明显的减少。提示MT可以抵抗Aβ1-42对小脑皮层神经元的神经毒性作用。
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| Fig 1 HE staining of cerebellar cortex in each group (×200) A:Control group; B: AD group; C: MT group; D: AD+MT group. ML: Molecular layer; PL: Purkinje layer; GL: Granular layer |
如Fig 2所示，与对照组相比，AD组颗粒细胞层NeuN的荧光强度明显降低(P < 0.01)；与AD组相比，AD+MT组NeuN的荧光强度明显上调(P < 0.01)；对照组与MT组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。提示MT在不影响正常生理状态小脑颗粒细胞的情况下，抑制Aβ1-42对小脑皮层颗粒细胞的损害作用。
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| Fig 2 Fluorescence level of NeuN in rat cerebellar cortex of each group (×200) A:Immunofluorescent staining for NeuN in the cerebellum; B: Statistic data represent the relative expression of NeuN(x±s, n=12). ML: Molecular layer; GL: Granular layer; WM: White matter.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AD group. |
如Fig 3所示，与对照组相比，AD组中浦肯野细胞的个数明显减少(P < 0.01)。AD+MT组与AD组相比，浦肯野细胞个数明显增多(P < 0.01)；对照组与MT组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。提示MT在不影响正常生理状态小脑浦肯野细胞的情况下，阻止由Aβ1-42引起的小脑浦肯野细胞的减少。
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| Fig 3 Number of Purkinje cells in rat cerebellar cortex of each group (×200) A:Immunofluorescent staining for Calbindin in the cerebellum; B: Statistic data for the number of Purkinje cells(x±s, n=12).ML: Molecular layer; PL: Purkinje layer; GL: Granular layer.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AD group. |
Fig 4的免疫荧光结果显示，与对照组比较，AD组中p-ERK的荧光强度明显增加(P < 0.01)；AD+MT组与AD组相比，荧光强度明显降低(P < 0.01)。Fig 5的Western blot结果显示，AD组中p-ERK1/ERK1的蛋白表达水平较对照组明显增加(P < 0.01)；AD+MT组p-ERK1/ERK1的蛋白表达水平与AD组相比降低(P < 0.01)，p-ERK2/ERK2在各组中的蛋白表达水平差异无统计学意义。提示MT在一定程度上抑制了MAPK/ERK信号通路的激活。
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| Fig 4 Fluorescence level of p-ERK in rat cerebellar cortex of each group (×200) A: Immunofluorescent staining for p-ERK in the cerebellum; B: Statistic data represent the relative expression of p-ERK(x±s, n=12). ML: Molecular layer; GL: Granular layer.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AD group. |
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| Fig 5 Relative expression of p-ERK/ERKin rat cerebellum of each group (x±s, n=9) **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AD group |
AD是最常见的老年期痴呆类型，其临床特征表现为隐袭起病、进行性的记忆和认知功能减退，多伴有人格、精神异常，是年龄相关的神经系统退行性疾病[11]。关于AD的研究主要集中在大脑半球的海马和皮层的病理学改变，小脑的改变总是被忽略。但解剖学、临床和神经影像学方面的研究提示，AD患者的小脑在神经功能和组织学方面也伴随改变，这些改变主要是小脑灰质体积的缩小、重量的减轻、浦肯野细胞的减少、分子层的萎缩和神经胶质细胞的增生[3]。在AD患者的小脑中，Aβ1-42的含量也较对照组高出2倍之多[12]。越来越多的证据表明，可溶性Aβ1-42在AD的病理学改变中发挥重要作用，而且被认为是AD发生和发展的扳机点。Aβ可以和脑内过氧化氢酶相互作用，损伤其清除H2O2的能力，引发活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生，最终导致脂质、蛋白质或DNA的氧化损伤，从而导致细胞功能障碍和神经元死亡[13]。
MT作为一种多功能的神经激素，在AD中具有各种保护作用，除了能对抗Aβ引发的氧化应激损伤, 有效保护神经元。同时，MT通过调节Aβ前体蛋白的代谢，抑制β折叠，使β折叠结构变成无规则线圈样结构，易于被机体清除，阻止可溶性的Aβ聚集成具有神经毒性的纤维状态，而且还具有抗炎和调节线粒体功能的作用。因此，MT是一种有潜力的AD预防和治疗的药物。本实验的HE染色结果显示，AD组小脑的分子层萎缩变薄，细胞数减少，颗粒细胞层的细胞数也减少，而AD+MT组并未出现明显的组织学改变。免疫荧光NeuN、Calbindin的结果显示，AD组小脑皮层颗粒细胞及浦肯野细胞与对照组相比均减少，AD+MT组与对照组及MT组相比，无统计学意义。同时Calbindin免疫荧光也显示，AD组的浦肯野细胞胞体缩小、变形。这些结果提示，提前给予MT可以有效阻止Aβ1-42诱导的神经毒性作用，抑制小脑皮层的萎缩，颗粒细胞、浦肯野细胞数的减少及浦肯野细胞胞体的缩小变形，发挥对小脑皮层神经元的保护作用，与已知文献结果一致[6]。
MAPK通路是细胞外信号引起核反应的细胞信息传递的汇聚通路之一，p38、JNK和ERK被认为是MAPK信号传导途径的3个关键组成部分。活化的MAPK信号通路与AD的致病机制密切相关，Aβ引起的各种MAPK磷酸化状态，导致突触功能障碍、认知能力的下降、氧化反应、炎症反应及凋亡过程。在AD中，纤维状Aβ1-42可诱导ERK激活，ERK1/2信号通路的持续激活，引起caspase-3以剂量和时间依赖性激活，导致Tau的异常磷酸化、营养不良神经突的产生和进行性神经元变性；给予MEK-ERK1/2抑制剂后，明显减弱了Aβ1-42低聚物诱导的毒性作用，同时ERK1/2和caspase-3的活化降到较低的水平。抑制ERK的激活，还可使线粒体的裂变与融合达到平衡，防止线粒体形态和功能的异常，减少氧化应激反应[14]。MT作为强效的抗炎、抗氧化及神经保护因子，在创伤性脑损伤中，抑制ERK1/2信号通路激活，并抑制急性期神经细胞凋亡，从而保护脑组织，避免继发性损伤。在本次实验中，免疫荧光的结果提示，MT可以抑制ERK的激活，阻止Aβ1-42诱导的神经毒性作用。另有一些文献表明，Aβ通过下调ERK的激活，产生神经损害作用。查阅大量文献发现，ERK在AD患者和AD动物模型的不同时期，其mRNA和蛋白质的表达量不相同。ERK主要存在于细胞树突、轴突及活化的星形胶质细胞中。在AD早期，星形胶质细胞中ERK广泛活化。相对于正常对照和疾病早期, 在晚期阶段(尽管在星形胶质细胞中一些ERK仍然存在)，神经元细胞体和营养不良神经突中的ERK激活被抑制。因此，ERK的高或低活化，均可能有助于疾病的发生。本实验的Western blot结果提示，AD组的ERK1磷酸化水平明显升高，与AD组相比，AD+MT组的ERK1磷酸化水平明显下降，ERK2的磷酸化水平在各组中无统计学意义，说明MT可能是通过抑制ERK1的激活，发挥对小脑的保护作用。目前关于ERK1和ERK2的研究甚少，它们分别在信号级联中的作用及其间的关系有待进一步研究。
综上所述，MT可以保护小脑免受Aβ1-42介导神经毒性作用，其机制可能与抑制MAPK/ERK信号通路相关，为临床应用MT预防及治疗神经退行性疾病提供了必要的理论基础。
( 致谢: 本实验在辽宁省神经退行性疾病重点实验室、锦州医科大学基础医学院神经生物学教研室完成，在研究完成过程中得到了各位老师及同学的指导和热忱帮助，在此深表谢意！)
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