2. 南京中医药大学 医学与生命科学学院，江苏 南京 210023;
3. 南京中医药大学 心理学院，江苏 南京 210023;
4. 南通大学神经再生协同创新中心，江苏 南通 226001
2. School of Medicine and Life Sciences, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
3. School of Psychology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
4. Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu 226001, China
抑郁症是由神经再生和神经内分泌功能障碍引起的精神健康障碍[1]，主要表现为心情低落、失去兴趣等，常伴有自杀倾向，危害人类健康。众多研究表明，抑郁、焦虑和其他情感障碍疾病都与皮质酮水平有关[2]。长期给予啮齿类动物过量皮质酮能够诱导产生抑郁焦虑样行为，高浓度的糖皮质激素(啮齿类动物为皮质酮)会结合大量受体，并引起海马脑区功能异常，从而导致焦虑、抑郁等情绪疾病发生[3]。因此，给予糖皮质激素对神经造成的损伤通常可以作为研究应激对神经损伤的抑郁模型。
应激能够抑制海马中神经新生的水平，促进焦虑和抑郁的病程发展[4]。Duan等[5]研究表明，通过建立抑郁模型，神经新生水平下降，而经过抗抑郁治疗能够促进神经新生。近来研究表明，行为学的缺陷和海马齿状回(dentate gyrus，DG)细胞增殖的减少是由于皮质酮水平改变造成的，而这一现象可以被单胺类抗抑郁药物所逆转[6]。这些结果提示，海马神经新生是抗抑郁药物发挥治疗作用的重要分子机制之一。
目前，临床上用于治疗抑郁症的药物大多起效缓慢。越鞠丸出自《丹溪心法》，由栀子、苍术、香附、川芎、神曲5味药组成，是治疗郁证的经典方。前期研究发现，越鞠丸醇提物具有快速起效的抗抑郁作用，cAMP依赖蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase, PKA)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)参与了越鞠丸的快速抗抑郁作用[7]。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)则在cAMP/PKA/CREB信号通路中也起到重要的调节作用。但越鞠丸是否作用于海马神经新生仍不清楚。本研究拟采用行为学方法，检验越鞠丸对皮质酮诱导抑郁模型小鼠的抗抑郁效果，结合免疫组化及Western blot技术，检测越鞠丸对海马神经新生及PKA-ERK-CREB信号通路蛋白表达的影响，进而探讨越鞠丸通过神经新生产生抗抑郁作用的分子机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级C57BL/6N小鼠，♂，7~8周龄，体质量20~24 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(苏)2016-0010。实验前，小鼠适应饲养环境1周，环境温度20~24 ℃，湿度40%~60%，昼夜交替时间12 h，动物自由摄食饮水。
1.2 药物与试剂实验用越鞠丸，购自江苏七零七天然制药有限公司成品药(批号170401)，将药丸用粉碎机粉碎，按0.2 kg·L-1与生理盐水充分混合后，超声1 h，放入4 ℃冰箱保存备用。皮质酮(corticosterone，CORT，批号：95H0092)，购自美国Sigma公司；蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)；RIPA裂解液(Beyotime，货号：P0013B)；蛋白酶抑制剂Cocktail(货号：5871S)、一抗PKA(货号：5842)、CREB(货号：9197)、p-CREB(货号：9198)、ERK(货号：9102)、p-ERK(货号：4376)，均购自CST公司；β-tubulin(Epitomics，货号：1879-1)；Ki67抗体(Proteintech，货号：27309-1-ap)；ECL显色液(康为世纪，货号：2514K)。
1.3 仪器动物行为分析系统(美国Any-maze公司)；纯水机(美国Millipore公司)；电泳转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Tannon-5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；CM1950冰冻切片机(德国Leica公司)；BX51型显微镜(日本Olympus公司)。
2 方法 2.1 皮质酮诱导抑郁小鼠模型的建立及越鞠丸给药实验小鼠随机分为3组：空白对照组(Con)、模型+生理盐水组(Mod)、模型+越鞠丸组(YJ)。其中，模型组和越鞠丸组按照20 mg·kg-1的剂量皮下注射皮质酮混悬液(皮质酮先溶于DMSO中，然后加生理盐水配成2 g·L-1混悬液，超声振荡混匀)，连续给药4周；空白组注射等体积生理盐水。越鞠丸组在造模第4周时，同时进行中药灌胃[8]。
2.2 行为学测试 2.2.1 糖水偏好测试造模前，给予实验小鼠质量分数为2%的蔗糖溶液进行适应。禁水16~18 h后，将小鼠单笼放置。给予小鼠2%蔗糖溶液、纯净水各1瓶，2 h后观察蔗糖消耗量。蔗糖消耗百分比计算公式为：蔗糖消耗=[(蔗糖消耗量)/(蔗糖消耗量+纯水消耗量)]×100%。
2.2.2 悬尾测试将小鼠尾部贴在钩子上，倒挂在测试箱内，用摄像机记录6 min小鼠的行为，记录后4 min内小鼠的不动时间。
2.2.3 陌生环境摄食测试小鼠禁食24 h后，将其从固定一角放入一个新的测试箱内，测试箱中心放置预称量的粮食。摄像机记录10 min。观察小鼠首次进食的潜伏时间以及单位时间的摄食量。记录潜伏期和消耗食物的重量。单位时间摄食量计算公式：单位时间摄食量/g= 10 min内消耗粮食重量(g)/小鼠体质量(g)。
2.3 免疫组化法检测Ki67+细胞数量实验小鼠用质量分数为3.5%的水合氯醛麻醉，开胸，先灌注生理盐水，再用质量分数为4%的多聚甲醛灌注固定，取脑。质量分数为4%的多聚甲醛固定1 d，质量分数为30%的蔗糖脱水，冰冻切片(厚度为30 μm)，PBS漂洗3次，4 ℃冰箱备用。临用时，用PBS洗脑片3次，室温封闭1 h后，再用PBS洗1次，加入Ki67抗体，1 d后吸出一抗，用PBS洗3次，加入二抗(1:1 000)，避光孵育1 h，PBS洗3次。贴片后显影。观察并计数各组小鼠海马DG区Ki67+细胞数。
2.4 Western blot法检测蛋白表达水平Western blot法检测PKA、ERK及CREB的表达水平。实验小鼠取脑部海马组织，提取蛋白并测定浓度。电泳分离蛋白质，湿转法将蛋白转至PVDF膜上。转膜后，用3% BSA于室温封闭膜1 h，分别加入PKA、CREB、p-CREB、ERK、p-ERK及β-tubulin的抗体，4 ℃孵育过夜。用TBST漂洗3次，各10 min，再将洗好的PVDF膜放入二抗孵育1 h。用TBST漂洗3次，各10 min，加入ECL发光底物后显色。采用全自动化学发光图像分析系统显影分析。采集目的蛋白与内参β-tubulin灰度值，得到各样本蛋白的灰度比值。
2.5 统计学分析所有数据均用SPSS 20.0统计分析软件进行分析，多组数据间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 越鞠丸给药能够逆转皮质酮诱导产生的小鼠抑郁样行为通过给予皮质酮构建小鼠抑郁模型，在造模最后1周每天灌胃越鞠丸(2 g·kg-1)，造模结束后，进行行为测试并取材(Fig 1A)。结果显示，注射皮质酮4周后，模型组小鼠体质量明显低于正常对照组(P < 0.01)，给予越鞠丸对体质量没有恢复作用(Fig 1B)。皮质酮造模后，小鼠出现快感缺失表型，糖水偏好程度出现明显下降(P < 0.05)，给予越鞠丸能够修复这一不良表型(P < 0.05，Fig 1C)。进一步检测小鼠的绝望行为，结果也显示，造模后小鼠的不动时间明显增加(P < 0.01)，越鞠丸能够明显降低不动时间(P < 0.05，Fig 1D)。在陌生环境摄食测试中，结果显示，皮质酮造模能够明显增加小鼠的首次摄食延迟时间(P < 0.01，Fig 1E)，并明显降低总摄食量(P < 0.05，Fig 1F)，越鞠丸能够逆转这一现象(P < 0.05)。这些结果均提示，越鞠丸给药能够修复皮质酮诱导的抑郁样行为。
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| Fig 1 Effect of Yueju pill on depressive behavior induced by CORT (x±s, n=8) A:CORT treatment paradigm and behavior test; B: Weight of mice after 4-week treatment; C: Effect of Yueju pill and CORT on sucrose preference; D: Effect of Yueju pill and CORT on immobility time in TST; E: Effect of Yueju pill and CORT on latency in NSF; F: Effect of Yueju pill and CORT on food intake in NSF.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs model group. |
海马神经新生的重要内源性指标是Ki67的阳性细胞数量，检测海马新生重要脑区DG区的Ki67细胞数量的结果显示(Fig 2)，皮质酮诱导的小鼠海马DG区Ki67阳性细胞数量明显减少(P < 0.05)，给予越鞠丸的小鼠Ki67细胞数量与模型组相比明显增加(P < 0.05)，提示越鞠丸能够增强海马神经新生。
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| Fig 2 Effect of Yueju pill on Ki67 positive cells in DG of hippocampus in CORT-induced mice A:Distribution image of Ki67+ cells in DG of hippocampus(×40);B: Number of Ki67+ cells in DG of hippocampus(x±s, n=6).*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group. |
如Fig 3所示，与对照组比较，模型组小鼠海马中PKA、总CREB和总ERK蛋白表达均明显下降(P < 0.05)；给予越鞠丸后，海马中PKA、总CREB和总ERK蛋白表达均明显上升(P < 0.05)，而p-CREB和p-ERK表达则无明显变化。
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| Fig 3 Effect of Yueju pill on PKA-ERK-CREB signaling pathway in CORT-induced mice (x±s, n=8) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group |
本研究通过对小鼠注射皮质酮来诱导产生抑郁样行为，并分析越鞠丸给药对该模型小鼠的作用。结果显示，越鞠丸能够修复皮质酮诱导产生的抑郁样表型；进一步检测小鼠海马DG区神经新生重要靶点Ki67阳性细胞数量，发现越鞠丸能够逆转皮质酮诱导产生的Ki67阳性细胞数量下降，从而增强海马神经新生；另外对胞内信号通路分子研究结果显示，越鞠丸能够增加PKA和ERK及其下游CREB分子信号的表达水平，提示越鞠丸增强海马神经新生是通过激活PKA-ERK-CREB信号通路实现的。
越鞠丸常用于郁证的治疗，我们前期研究结果支持越鞠丸的抗抑郁作用具有快速性的特点：运用动物模型实验发现，越鞠丸醇提物单次灌胃1 d后，即可检测到对获得性无助抑郁行为的缓解作用[9]，而常规单胺类药物在此模型上至少需要7 d以上处理时间才能起作用[10]，并且越鞠丸的快速解郁与氯胺酮作用效果相似。然而，临床上应用越鞠丸大多采用重复给药方式，进一步我们在小鼠研究中也发现，越鞠丸重复给药也能够起到抗抑郁作用[8]。本研究则在广泛应用的皮质酮诱导小鼠抑郁样表型的模型上，探索越鞠丸作用的分子机制。皮质酮水平的变化对抑郁行为有重要的影响，Camargo等[11]研究发现，慢性的糖皮质激素水平升高可以导致抑郁样表型，而慢性皮质酮水平增高可以模拟人类压力引发的抑郁症。在此基础上，本研究在皮质酮诱导抑郁模型小鼠中验证了越鞠丸给药的抗抑郁作用，发现通过1周的给药能够迅速逆转皮质酮诱导产生的抑郁样行为，改善糖水偏好、悬尾测试的不动时间，同时在陌生环境摄食行为中也获得了相一致的结果。证明越鞠丸能够在不同类型的小鼠抑郁模型中获得一致的结果，提示其抗抑郁作用具有广泛性。
抗抑郁药可能通过保护受损海马神经元，并促进其新生的方式来起到抗抑郁作用。Hodes等[12]发现，氟西汀给药可以明显增强小鼠海马DG区神经细胞的新生。单次给予氯胺酮能够快速提高海马神经新生，这也是其快速抗抑郁的可能作用机制之一。因此，神经新生对于抑郁症发病机制及抑郁症治疗有着十分重要的作用。海马神经新生的重要内源性指标是Ki67的阳性细胞数量，因而本研究检测了海马新生关键脑区齿状回的Ki67阳性细胞数量。结果提示，越鞠丸给药能够明显改善皮质酮诱导的小鼠海马神经细胞损伤，促进海马神经元细胞增殖，说明越鞠丸抗抑郁的作用很可能是通过增强神经元增殖来实现的。
研究表明，CREB信号的激活能够增加海马DG区神经元的增殖[13]，从而介导行为的改变。此外，海马神经新生需要多条信号通路参与，包含很多种转录因子，而CREB也是其中非常重要的一个转录因子[14]。前期研究发现，越鞠丸可以迅速增强海马的BDNF表达，并持久激活CREB信号，提示CREB及其相关的突触可塑性信号在介导越鞠丸抗抑郁中可能发挥主导作用。PKA-CREB信号通路在抑郁症的发病机制和抗抑郁机制中起着重要作用，Xue等[7]研究显示，与抑郁模型小鼠相比，越鞠丸给药小鼠的海马中PKA、CREB信号明显上调，说明越鞠丸特异性地作用于该信号通路。本研究进一步检测了越鞠丸给药对皮质酮诱导抑郁小鼠模型中PKA-CREB信号通路蛋白表达的影响。结果显示，越鞠丸给药也可上调皮质酮诱导抑郁小鼠海马中PKA、总CREB、总ERK的表达水平，这与前期在习得性无助模型上，发现越鞠丸给药能够激活PKA-CREB信号通路并起到抗抑郁作用的研究结果相一致[8]，说明在不同模型上越鞠丸作用的分子机制是相类似的。本研究中，p-CREB与p-ERK表达没有变化，提示越鞠丸的抗抑郁作用是通过提高CREB和ERK蛋白表达总量来实现的，这与之前报道，越鞠丸能够上调KM小鼠海马组织CREB和ERK磷酸化表达水平的结果不一致[11]。究其原因，可能是由于小鼠品系差异造成的。在本课题组另一项研究中也发现，急性给予越鞠丸的抗抑郁作用仅能够在C57BL/6N小鼠上维持24 h(投稿中)。也有文献报道，不同时间应激对p-ERK与p-CREB的含量调控是双向的[15]，因此，磷酸化蛋白变化与抗抑郁作用变化并不一定完全一致。本研究的结果也从另一侧面说明PKA-ERK-CREB信号通路对于维持抗抑郁药物的作用非常重要。
本研究在经典的皮质酮诱导抑郁模型中验证了越鞠丸的抗抑郁作用，并且进一步分析了其内在分子机制。结果提示，越鞠丸给药可以提高海马神经新生细胞数量，上调PKA、CREB、ERK表达水平，因而其抗抑郁作用可能是通过激活PKA-ERK-CREB信号通路，进而增强海马神经新生来实现的。下一步应继续分析海马神经新生是如何参与了越鞠丸抗抑郁作用，以及突触可塑性与神经新生关系的具体分子机制，为其临床推广应用提供一定的理论依据。
( 致谢: 本研究在南京中医药大学基础医学院中医脑病重点实验室暨转化系统生物学与神经科学研究中心完成，感谢实验室主任陈刚教授给予的指导和帮助，特此致谢! )
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