心肌细胞通过各离子通道调节跨膜离子的电位差，保持心脏功能状态[1]。一旦心肌离子通道发生病变或动态平衡被打破，容易诱发多种心脏疾病，心律失常是最常见的表现形式。钠、钾、钙等常见离子通道在心肌细胞膜上分布最为广泛[2]。其中，电压门控性钠通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)亦称快钠通道，该通道可引发心肌细胞动作电位，并完成心脏传导，在维持心脏电生理过程中不可或缺[3]。钠通道作为Ⅰ类抗心律失常药物的作用靶点，但其治疗效果不到60%，因此，寻求疗效较好的抗心律失常新药并揭示其机制，始终是热点研究方向。
葛根是多年生落叶藤本豆科药用植物野葛[Pueraria lobate (Willd.) Ohwi]的干燥根[4]，始载于《神农本草经》，位列中品，性凉，味甘、辛，具有“解肌热、止烦渴、泻胃火”之效，作为中药方剂的经典配伍沿用至今，其发挥药理活性的主要成分是异黄酮类化合物，包括葛根素、大豆苷元、染料木黄酮等[5]。文献报道，大豆苷元(daidzein，DD)具有提高免疫、抗癌症、抑制骨质疏松、抗氧化、改善妇女经期等多种药理作用[6]。另有一些研究结果表明，在整体动物实验中，DD可对抗异丙肾上腺素[7]、乌头碱[8]、心肌缺血/再灌注损伤[9]等多种原因诱发的心律失常，能明显缩小心肌梗死面积和抑制心肌肥厚。临床使用黄豆苷元片治疗高血压病及症状性高血压、冠心病和眩晕症，但作用机制未明。有人推测DD的以上作用与其影响钠通道有关[10]，但缺乏证据支持。本实验运用全细胞膜片钳技术，以急性分离的心肌细胞为样本，直接观察DD对大鼠心室肌细胞INa的影响，以期为其今后的进一步开发及其临床应用提供理论依据。
1 材料 1.1 实验动物SPF级成年SD大鼠，体质量(250±50)g；出生d 1~3的SD乳鼠(♀♂兼用)，均由扬州大学比较医学中心供应，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2012-0004，使用许可证号：SYXK(苏)2012-0029。
1.2 药物与试剂DD (纯度≥98%，成都德思特生物技术有限公司)；牛磺酸、HEPES、葡萄糖(美国Sigma公司)；胶原酶Ⅱ(美国Worthington Biochemical公司)；河豚毒素(tetrodotoxin，TTX) (上海克拉玛尔试剂公司)；DMEM、胎牛血清FBS(美国HyClone公司)。
1.3 试剂配制无钙台式液(mmol·L-1):NaCl 136.0、KCl 5.4、HEPES 5.0、NaH2PO4·2H2O 0.33、MgCl2·6H2O 1.0、葡萄糖10.0，pH值用NaOH调至7.34~7.38；台式液：50 mL无钙台氏液中加1.8 mmol·L-1 CaCl2即可；酶液：无钙台式液中加入0.5 g·L-1的胶原酶Ⅱ、1 g·L-1的BSA和30 μmol·L-1的CaCl2；细胞保存液(KB液，mmol·L-1)：L-谷氨酸70.0、牛磺酸10.0、KCl 25.0、EGTA 0.5、HEPES 5.0、NaH2PO4·2H2O 10.0、葡萄糖11.0、HEPES 5.0、KOH 89.0，pH值用KOH调至7.35~7.40；钠电流电极外液(mmol·L-1)：NaCl 135.0、CsCl 5.4、CaCl2 2.4、MgCl2 2.1、CdCl2 0.35、HEPES 5.0、葡萄糖11.0，pH值用NaOH调至7.40；钠电流电极内液(mmol·L-1)：CsCl 133.0、NaCl 5.0、EGTA 10.0、TEACl 20.0、HEPES 5.0、MgATP 5.0，pH值用CsOH调至7.37~7.38；DD溶于DMSO，其终浓度控制低于千分之一。
1.4 仪器Patch clamp EPC 10膜片钳仪(德国HEKA Instrument公司)；P-97微电极拉制仪、MP-225三维操纵器(美国Sutter Instrument公司)；IX71倒置显微镜(日本Olympus公司)；BSA124S电子天平(美国Sartorius公司)；DIGIDATA-1440 A/D-D/A转换器(美国Axon Instruments公司)；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo公司)。
2 方法 2.1 乳鼠心肌细胞的分离和培养取SD乳鼠，浸泡75%乙醇中消毒，于无菌条件下开胸，取其心脏，在预冷的PBS中冲洗2~3次，将心肌组织剪成1 mm3的小块，转移至离心管中。加入0.25%的胰酶液，置37 ℃水浴箱中分4次消化，至出现拉丝絮状白色组织块。收集除第1次消化以外的细胞悬液于离心管中，离心5 min，弃上清液，加入含有胎牛血清的培养基终止对胰酶的消化，200目滤网过滤。再离心5 min，弃上清液，收集细胞，加入含有10%胎牛血清DMEM，制成单细胞悬液，静置在37 ℃、5% CO2孵箱中，差速贴壁1.5 h, 获得高纯度心肌细胞。后接种于培养皿中，隔24~48 h换液。
2.2 MTT法检测细胞活性于96孔板中每孔接种8 000~10 000个乳鼠心肌细胞，每孔100 μL。待细胞贴壁后，长满至80%开始实验。吸弃培养液，分别加入不同浓度的DD溶液(0、1、3、10、30、100、300 μmol·L-1)，平行5孔。药物分别作用24、48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g·L-1)，置孵箱中培养4~6 h，弃上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，经摇床低速晃板10 min后。在酶联免疫分析仪上490 nm波长处测A490，实验重复3次，取平均值。
2.3 心肌细胞的分离SD大鼠ip肝素钠2000 IU·kg-1，约10 min后ip 1%戊巴比妥钠(10 mL·kg-1)。待麻醉显效后，将大鼠仰位固定于鼠台，剪开胸腔充分暴露心脏，于降主动脉段快速剪下，置于4 ℃无钙台式液清洗，去除多余脂肪结缔组织，用缝线结扎主动脉，固定在Langendorff灌注架上。用台式液灌流，待心脏复跳2~3次后，随后加预先以100% O2饱和的无钙台式液灌流5~10 min，再用酶液循环灌流20~30 min，直至心脏明显胀大，触感较软，滴液浑浊微黄，即刻停止消化。实验过程灌流液温度维持在(37±0.5) ℃。在KB液中剪碎心肌组织，过滤，得单个游离心室肌细胞。于室温中静置10 min，弃上清液，加入KB液复悬，反复3次。
2.4 INa记录吸取细胞悬液于倒置显微镜培养皿中(皿中储存1 mL细胞外液)，静置5~10 min，待细胞贴壁后，选择横纹清晰、表面光滑、立体感强、静息舒展的长杆状心肌细胞进行后续实验操作，实验温度保持(22~25) ℃，湿度20%~40%。为除去细胞间大小误差，INa幅值用电流密度(pA/pF)来表示。
2.5 数据处理PatchMaster软件程序采集所记录电流，结合使用Origin 7.0和GraphPad Prism 6.0对数据进行转换分析和曲线拟合。以SPSS 19.0软件对实验数据进行统计处理，实验数据均以x±s表示，3组以上比较宜用F检验。
3 结果 3.1 DD对乳鼠心室肌细胞活性的影响用酶解法急性分离乳鼠心肌细胞，培养24、48 h后，给予终浓度1、3、10、30、100 μmol·L-1的DD，MTT法测定细胞活力。如Fig 1所示，与对照组(0 μmol·L-1)相比，不同浓度的DD对乳鼠原代心肌细胞活力均有影响。当细胞培养至24 h时，细胞活力在DD 1~100 μmol·L-1时有所降低，其中10 μmol·L-1时与对照组比较，细胞活力明显降低(P < 0.05)；当细胞培养时间延长至48 h，与对照组相比，DD在1~10 μmol·L-1时，随药物浓度增加，心肌细胞活力明显降低(P < 0.05)，当浓度增至30~100 μmol·L-1时，对心肌细胞活力的影响强度更明显(P < 0.01)；与24 h相比，细胞在48 h时，0~10 μmol·L-1 DD差异无显著性，30~100 μmol·L-1差异有显著性，且随药物浓度增加，细胞活力明显降低(P < 0.05)。由此提示，此浓度范围内的药物对细胞产生的毒性较大，DD的IC50在30~100 μmol·L-1。
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| Fig 1 Effects of different concentrations of daidzein on viability of neonatal rat ventricular myocytes (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs 24 h |
为记录DD对INa的影响，本实验使用方波单刺激方案，给予指令电压-80 ~20 mV，刺激脉宽30 ms，持续刺激时间20 ms的方波单刺激。Fig 2结果表明，可引出快速激活快速失活的的内向电流，该电流几乎可被15 μmol·L-1的高特异性钠通道阻滞剂TTX阻断，证实所记电流为INa。0.3 μmol·L-1 DD作用后，INa明显减小，待电流趋于稳定后，用细胞灌流槽冲洗5 min，该电流逐渐恢复，表明INa的减小确是由药物作用引发的。
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| Fig 2 Effects of daidzein on single stimulation of INa |
运用膜片钳的全细胞模式，刺激方案同“3.2”，使用细胞累积加药法，分别观察DD在0.1、0.3、1、3、10 μmol·L-1浓度下对心室肌细胞INa的作用。Fig 3结果表明，当给予DD 0.1 μmol·L-1后，其对INa影响微弱，而0.3、1、3、10 μmol·L-1的DD使得大鼠心室肌细胞INa从给药前(-53.9±6.35) pA/pF分别降至(-33.78±3.24) pA/pF、(-25.16±4.24) pA/pF、(-22.28±3.54) pA/pF和(-17.96±4.56) pA/pF；与对照组相比，0.3、1 μmol·L-1低浓度的DD就具备抑制效果，且效果明显(P < 0.01)，其对INa的抑制率分别约为37%和53%，具有统计学意义(P < 0.05)。提示DD呈浓度依赖性抑制Na+通道电流，随浓度增加，抑制作用愈强。
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| Fig 3 Effects of daidzein on INa, peak at different concentrations(x±s, n=8) **P < 0.01 vs control group |
为探究DD对心室肌细胞INa时间过程的影响，采用刺激方案同“3.2”。当0.3 μmol·L-1DD作用5 min后(Fig 4)，INa，peak明显降低(a段)，并随时间延长而减弱，后趋于稳定，电流幅值几乎不变(b段)。而在随后的洗脱过程中(c段)，INa，peak逐渐恢复，其INa，peak在随后的洗脱过程也是可逆的。
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| Fig 4 Effects of 0.3 μmol·L-1 daidzein on time course of INa, peak(x±s, n=8) |
在电压钳模式下，保持初电位-80 mV，给予-70~90 mV、阶跃5 mV、持续时间30 ms的方波串刺激，刺激频率0.5 Hz，记录给药前后INa。以膜电位为横坐标，对应的钠通道最大电流密度为纵坐标绘制I-V曲线。Fig 5结果表明，1、3、10 μmol·L-1DD作用后，使I-V曲线明显上移，INa渐渐减少，但不改变曲线形态、激活阈电位(-50 mV)、最大激活电压(-20 mV)和反转电位(95 mV)。给药前，INa的最大电流密度在-20mV时为(-44.90±1.05) pA/pF，而在1、3、10 μmol·L-1 DD的作用下，最大电流密度是(-22.30±2.03) pA/pF、(-15.41±1.58) pA/pF、(-12.45±2.35) pA/pF (P < 0.01)。可见，随浓度增加，最大电流密度明显减小。
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| Fig 5 Effects of daidzein on Ⅰ-Ⅴ curve of INa before and after perfusion(x±s, n=8) **P < 0.01 vs control group |
稳态激活曲线的电导值G由INa I-V曲线的部分数据转化而成。以相对电导G/Gmax[G=I/(V-Vrev)]为纵坐标，各膜电位为横坐标，采用Boltzmann方程G/Gmax=1/
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| Fig 6 Effects of daidzein on activation kinetics of INa(x±s, n=8) A:The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the activated primary currents of INa; B: The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein on the steady-state activation curve of INa. **P < 0.01 vs control group. |
采取双脉冲刺激法，保持电位-80 mV，条件脉冲从-140 mV开始逐步去极化至20 mV，阶跃10 mV，持续时间50 ms，然后再复极化至-30 mV，持续时间25 ms，引出记录钠通道失活电流。以相对电流I/Imax为纵坐标，各膜电位为横坐标作图，依据Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[(V-
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| Fig 7 Effects of daidzein on inactivation kinetics of INa(x±s, n=8) A:The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the inactivated primary currents of INa; B: The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein on the steady-state inactivation curve of INa. **P < 0.01 vs control group. |
在电压钳模式下，采用双脉冲刺激法，保持电位为-80 mV，给予去极化至-30 mV的刺激，刺激时间持续30 ms，回到保持电位持续5 ms后，再给予一系列去极化至-30 mV，30 ms的刺激，其中前后两个脉冲的间隔时间以5 ms的幅度逐渐增加，共计15个脉冲，来引出钠通道失活后恢复电流，以相对电流I/Imax为纵坐标，各膜电位为横坐标作图。依据One-phase association指数方程I/Ipre=1-exp(-t/τ)拟合，I/Ipre为后一个脉冲与前一个脉冲电流的比值，t为两脉冲间的时间间隔，τ为通道失活后再激活至电流最大值的恢复时间。Fig 8、Tab 1结果显示，DD使INa的失活后恢复曲线右移，而1 μmol·L-1DD使τ由给药前(11.31±0.13) ms变为(13.30±0.24) ms；同样给予3、10 μmol·L-1 DD后，τ为(15.49±0.32) ms和(21.35±0.22) ms，恢复时间明显延长(P < 0.01)。结果表明，DD可改变INa的失活后恢复动力学特征，呈浓度依赖性延缓INa从失活态向激活态转变。
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| Fig 8 Effects of daidzein on recovery kinetics after INa inactivation(x±s, n=8) A:The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the recovered primary currents of INa; B: The effect of 1, 3, 10 μmol·L-1 daidzein on the steady-state recovery curve of INa. **P < 0.01 vs control group. |
| Group | Concentration/μmol·L-1 |
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k | τ/ms |
| Control | - | -74.42±0.44 | 0.047±0.003 | 11.31±0.13 |
| DD | 1 | -79.74±0.45 | 0.065±0.001 | 13.30±0.24 |
| 3 | -82.81±0.59 | 0.075±0.001** | 15.49±0.32 | |
| 10 | -86.5±0.77 | 0.088±0.002** | 21.35±0.22** |
根据WHO统计，在2015年，有70%的人死于非传染性疾病，其中心血管疾病死亡人数达1 770万(31%)，且约25%的患者死亡是由心律失常引起的[11]。我国传统中医药中也有许多关于心律失常的记载和描述，如《伤寒杂病论》中的“脉浮、心动悸、怔忡”，中医脉学上的“促、结、迟、涩、芤脉”等，并留下了一些治疗经验方，如炙甘草汤、安神丸、葛根芩连汤等。DD作为葛根芩连汤君药葛根的有效活性成分，可对多种类型心律失常有治疗作用[12]。众所周知，心律失常发生的主要机制是心肌细胞自律性升高、心肌组织内形成折返和出现后除极[13]，钠通道是目前治疗心律失常的主要靶点之一[3]。
MTT实验结果显示，DD的IC50在30~100 μmol·L-1，本实验给药终浓度设定为0.3~10 μmol·L-1。采用膜片钳技术记录DD对大鼠心室肌细胞INa特性，结果表明，DD对I-U曲线的幅值具有抑制作用，呈剂量依赖性阻滞Na+内流；同时使其Na+通道激活过程缓慢，使通道开放程度降低，加快失活过程，明显延长Na+通道从失活态到静息态的恢复过程，即可延缓心室复极时INa的恢复，通过延长有效不应期来抑制快速性心律失常，降低钠通道的间隙兴奋性，这与Ⅰ类抗心律失常药物钠通道阻滞剂特性相关[3]，此分子水平的实验结果也与整体动物实验中DD的作用一致。因此，可以部分解释其抗心律失常作用机制。
有研究证实[14]，DD溶液在体内吸收迅速，表明其在急性心肌缺血和脑缺血等疾病中实用性较强，主要优先分布于心、脑、肝等脏器中，显示其在治疗心脑血管疾病较高特异性。另有文献报道[6]，DD也是一类天然植物雌激素，与哺乳动物雌激素17-β雌二醇的结构特征存在共性：有一对间距相近的羟基基团及一个酚环，这类结构的相似性决定了DD具有一定雌激素效应，雌激素在体内和体外可调节心肌细胞存活、抑制细胞凋亡等相关蛋白质的表达和激活，从而产生心脏保护作用，尤其可对过氧化物所致心肌缺血/再灌注的损伤起到保护作用。心肌缺血/再灌注损伤时，由于缺血心肌ATP生成减少，使得细胞膜上钠泵功能减弱，致大量Na+内流至细胞内，易引起细胞水肿，此时Na+可激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换，造成Ca2+跨膜通透性增加和内流超负荷。而且由于缺血心肌内酸中毒，在此过程中产生氧自由基(主要是OH-)，使得Na+-H+交换系统被激活，Na+-H+交换在排出细胞内H+的同时，大量Na+内流至细胞内，由此又在后除极达到阈电位水平后引起新的动作电位[15]。已知，目前的心脏活性药物几乎没有对一种离子通道具有绝对选择性，科学家通过构建Cav1.2和Nav1.5通道蛋白模型，发现钠钙通道之间存在结构相似性，很好地解释其发生交叉反应的可能性[16]。
综上所述，DD可能是对大鼠心室肌细胞Na+通道电流具有抑制效应，从而发挥抗心律失常的作用。后期可在古方基础之上继续深入挖掘，从心室肌细胞钙通道和钾通道等多种途径，系统探究该药能影响离子通道的哪些亚型，为该药的进一步开发、利用及更好地指导临床用药提供理论依据。
( 致谢: 本实验在扬州大学医学院细胞膜片钳室和药学实验中心完成，感谢本课题组老师和全体同学的指导与帮助 )
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