2. 天津市新药非临床评价技术工程中心GLP实验室，天津 300301;
3. 山东省科学院生物研究所药物筛选技术重点实验室，山东 济南 250014
2. Tianjin Engineering Research Center of Drug Preclinical Assessment Technology, GLP Lab, Tianjin 300301, China;
3. Shandong Province Biology Institute of Shandong Academy of Sciences, Key Lab for Drug Screening Technology, Ji'nan 250014, China
斑马鱼作为一种公认的新型模式生物，目前被广泛应用于医药、环境等多个研究领域[1-2]。在斑马鱼实验中，检测终点和染毒频率不同，可能导致被检物的毒性表现发生明显差异，从而影响被检物毒性的准确判断。目前各领域对斑马鱼检测终点的选取未形成共识[1, 3-5]，染毒频率的设定也参差不齐[2, 4]。本研究针对检测终点和染毒频率建立验证实验，阐明其对斑马鱼药物评价模型的影响，尝试摸索最佳实验方法，为更好地进行药物毒性的早期筛选提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂SZX16型体视荧光显微镜、DP2-BSW图像采集系统(Olympus公司); 斑马鱼养殖饲养系统(北京爱生科技有限公司)。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA，Sigma公司); 抗坏血酸(ascorbic acid，AA，天津市化学试剂供销公司); 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，生工生物工程上海股份有限公司); 三卡因(化学名3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Fluka公司); 钙黄绿素(Sigma公司)。DMSO配制成储备液，-20℃保存备用，使用前用斑马鱼胚胎培养用水(5 mmol·L-1 NaCl、0.17 mmol·L-1 KCl、0.4 mmol·L-1 CaCl2、0.16 mmol·L-1 MgSO4)稀释为70 mmol·L-1用于实验。
1.2 鱼卵制备健康性成熟的AB系斑马鱼所产受精卵，于受精2 h时经脱膜处理后，挑选受精6 h的健康脱膜斑马鱼胚胎用于实验。
1.3 实验方法实验共设9组，分别为空白对照组(胚胎培养用水)、溶剂对照组(DMSO，70 mmol·L-1)、阴性药物组(AA，10 mg·L-1)、阳性药物组(ATRA设置6个检测浓度：0.625、1.25、2.5、5.0、7.5、10 μg·L-1)。斑马鱼胚胎移入6孔培养板中，每孔30枚，每组3个重复孔。每24 h更换4/5的药液，连续染毒5 d。每天计数死亡受精卵和幼鱼数，计算累积死亡率，对照组累积死亡率应不高于10%。实验结束时，显微镜下观察存活幼鱼自主活动情况; 利用1 mmol·L-1三卡因麻醉幼鱼，固定焦距对侧面、背面照相，首先对每条存活幼鱼的形态发育进行镜下观察，随后每组选择6条幼鱼对体节、脊索、尾、鳍(胸鳍、背鳍、腹鳍、尾鳍)、脑、上面部结构(眼、耳囊、嗅区)、下面部结构(上下颚)、心脏、体形、肝、鳔的发育进行评分，并根据各组织器官评分情况，对每条斑马鱼进行总体评分[6]。将麻醉的幼鱼用3.2 mmol·L-1的钙黄绿素溶液染色，荧光显微镜下计数鱼体中具有荧光染色的脊椎骨(矿化椎骨)并拍照。
1.4 观察时间研究另取9组斑马鱼胚胎，在染毒5 d时去掉药液，加入胚胎培养用水，至d 7结束实验，观察斑马鱼幼鱼发育情况。其他实验方法同“1.3”项。
1.5 换液频率研究另取9组斑马鱼胚胎，在d 1时加入药液，实验期间不换液，在染毒5 d时结束实验，观察幼鱼发育情况。其他实验方法同“1.3”项。
1.6 统计学方法实验数据用x±s表示，使用SPSS 20.0软件进行统计分析。由于各组间方差不齐，因此进行非参数Kruskal-Wallis检验。
2 结果 2.1 对死亡率的影响如Tab 1所示，空白对照组、溶剂对照组和阴性药物组平均死亡率均 < 10%，但5 d不换液实验的死亡率较换液实验略有升高。ATRA各给药组，给药5 d每天换液和不换液实验各组的死亡率均≤10%，但不换液实验大部分组别的死亡率略低; 7 d换液实验，0.625、1.25、2.5、5.0 μg·L-1组死亡率较低，能保证有足够数量的胚胎用于发育评价，7.5、10 μg·L-1两组死亡率明显升高。
| Group | 5 d changing | 7 d changing | 5 d no-changing |
| Control | 2.22±1.92 | 6.67±5.77 | 10.00±10.00 |
| DMSO | 3.33±3.34 | 0.00±0.00 | 10.00±17.32 |
| AA | 3.33±5.77 | 6.67±5.77 | 6.67±11.55 |
| ATRA 0.625 μg·L-1 | 0.00±0.00 | 6.67±11.55 | 0.00±0.00 |
| ATRA 1.25 μg·L-1 | 6.67±5.77 | 3.33±5.77 | 0.00±0.00 |
| ATRA 2.5 μg·L-1 | 10.00±0.00 | 13.33±5.77 | 3.33±5.77 |
| ATRA 5.0 μg·L-1 | 6.67±5.77 | 6.67±5.77 | 10.00±17.32 |
| ATRA 7.5 μg·L-1 | 3.33±5.77 | 26.67±5.77 | 0.00±0.00 |
| ATRA 10 μg·L-1 | 3.33±5.77 | 73.33±15.28** | 0.00±0.00 |
| **P < 0.01 vs DMSO | |||
空白对照组、溶剂对照组和阴性药物组存活幼鱼均能自由游动; ATRA给药组存活幼鱼，低浓度下仅部分个体游动迟缓，随浓度增加，游动能力逐渐丧失至无法正常游动。观察时间和换液频率对存活幼鱼自主活动的影响不明显。
2.3 对形态发育的影响3种实验方法中，空白对照组、溶剂对照组和阴性药物组存活斑马鱼无明显畸形，仅见阴性药物组个别斑马鱼的体形、尾部、胸鳍、心出现发育延迟; ATRA经梯度浓度暴露后，呈现明显的正相关剂量-效应关系。如Fig 1所示，在给药5 d换液实验中，0.625、1.25、2.5 μg·L-1组斑马鱼仅鳍条有轻微的边缘不规则，尾部轻微弯曲，头部形态轻微异常，如脑部比例的微小变化; 5.0 μg·L-1组脊索和体节不规则，靠近尾部的体节发育受阻，尾部严重弯曲，鳍条发育不全，头部嗅区发育受阻，脑部发育尺寸异常，心脏、肝脏部位发育异常，鳔发育不全或不充气，个别个体出现水肿; 7.5、10 μg·L-1组严重畸形，水肿严重，脊索和体节不规则、不明晰，部分体节缺失，尾部扭曲，鳍条发育不全，两侧胸鳍严重异常、变小、不规则，眼睛小，上下颚、嗅区、耳蜗、脑部严重变形，各部位尺寸和比例失调，心脏、肝脏部位难以辨清，10 μg·L-1组比7.5 μg·L-1组畸形程度略严重。延长观察时间后，5.0、7.5、10 μg·L-1组部分个体腹部或尾部出现异常增生，7.5、10 μg·L-1组水肿程度略加重，总体评分可见2.5、5.0 μg·L-1组评分降低。不换液实验中，可见各组畸形程度略轻，5.0、7.5 μg·L-1组总体评分有所升高。评分结果见Tab 2。
|
| Fig 1 Development of zebrafish in ATRA treated groups |
| Group | 5 d changing | 7 d changing | 5 d no-changing |
| Control | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 |
| DMSO | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 |
| AA | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 | 5.0±0.0 |
| ATRA 0.625 μg·L-1 | 3.0±0.0 | 3.0±0.0 | 3.0±0.0 |
| ATRA 1.25 μg·L-1 | 3.0±0.0 | 3.0±0.0 | 3.0±0.0 |
| ATRA 2.5 μg·L-1 | 3.0±0.0 | 1.7±0.8* | 3.0±0.0 |
| ATRA 5.0 μg·L-1 | 1.2±0.4** | 1.0±0.0** | 1.3±0.5** |
| ATRA 7.5 μg·L-1 | 1.0±0.0** | 1.0±0.0** | 1.2±0.4** |
| ATRA 10 μg·L-1 | 1.0±0.0** | 1.0±0.0** | 1.0±0.0** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control, DMSO and AA | |||
空白对照组、溶剂对照组、阴性药物组均有一定数量的椎骨发生钙化，7 d实验的空白对照和溶剂对照组斑马鱼矿化椎骨数较5 d实验有所增加。给药5 d换液与不换液实验中，ATRA各给药组的矿化椎骨数均为零，可见ATRA抑制斑马鱼的骨骼钙化，但未能体现剂量效应; 在7 d换液实验中，ATRA 0.625、1.25 μg·L-1给药组幼鱼出现少量矿化椎骨，呈现一定的剂量-效应关系。见Tab 3。
| Group | 5 d changing | 7 d changing | 5 d no-changing |
| Control | 1.2±1.5 | 2.7±0.5 | 0.7±1.2 |
| DMSO | 0.8±1.0 | 2.5±1.9 | 0.7±1.2 |
| AA | 2.0±0.9 | 1.7±1.0 | 1.8±0.8 |
| ATRA 0.625 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.7±1.2 | 0.0±0.0## |
| ATRA 1.25 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.7±0.8 | 0.0±0.0## |
| ATRA 2.5 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.0±0.0** | 0.0±0.0## |
| ATRA 5.0 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.0±0.0** | 0.0±0.0## |
| ATRA 7.5 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.0±0.0** | 0.0±0.0## |
| ATRA 10 μg·L-1 | 0.0±0.0## | 0.0±0.0** | 0.0±0.0## |
| **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs AA | |||
斑马鱼作为新的模型动物，具有周期短、投入少等诸多优势，但较大鼠、小鼠、家兔等成熟动物模型，还有很多不确定因素需要摸索和探讨。斑马鱼受精卵48~72 h即可孵化成鱼，但刚孵出的幼鱼器官发育尚不完全成形、游动能力低，不利于发育评价和自主活动的观察。因此，本实验基础染毒周期和观察时间定为受精后1~5 d，覆盖胚胎早期发育和各器官形成期; 并在5 d染毒实验的基础上，对斑马鱼模型的观察终点和染毒频率进行探讨性研究。
在染毒5 d后延长观察2 d的实验中，斑马鱼死亡率较5 d实验升高、形态发育畸形程度加重，可见毒性作用的延迟表达。5.0 μg·L-1染毒浓度下，ATRA对斑马鱼的致畸程度已与5 d实验中7.5 μg·L-1基本一致，两组总体评分相同，可见适当延后观察终点会使评价物的毒性剂量降低、毒性等级升高，对被检物的安全性判定更加谨慎，同时也趋向保守。另外由骨骼发育结果可知，5 d染毒实验虽然可呈现ATRA对椎骨矿化的抑制，但由于对照组的矿化椎骨数即较少，并无剂量-效应关系，受骨骼发育阶段的影响较大; 将观察时间适当延长后，可显示不同给药量下的剂量-效应关系，能更好地呈现药物对骨骼发育的影响，因此在需要观察骨骼发育情况的评价研究中，观察终点的适当延后更加必要。
在染毒5 d不换液实验中，两个对照组的死亡率较换液实验略偏高，可见换液频率对斑马鱼的发育质量有一定的影响。同时各对照组的死亡率皆不超过10%，从一个侧面说明斑马鱼对培育环境要求较低，使斑马鱼模型的广泛推广应用成为可能。该实验ATRA染毒斑马鱼死亡率较换液实验偏低、形态发育畸形程度减弱、明显致畸剂量升高(10 μg·L-1)，可见药物毒性作用表达不充分。同时，对照组死亡率偏高，又降低了毒性作用的检出概率，使被检物的毒性判定较实际偏低，增加了药物研发的风险。
综上所述，使用斑马模型进行药物毒性的早期筛选时，在染毒时间贯穿胚胎发育全程、规律重复染毒的基础上，适当增加观察时间有利于毒性作用的充分表达，尤其在需要进行骨骼发育评价时变得更加必要。但延长观察时间可能使毒性剂量/浓度降低、毒作用增强，使检测结果趋向保守，在药物研发过程中对预期前景的瞻望应考虑该因素的影响。
( 致谢: 本实验在山东省科学院生物研究所药物筛选技术重点实验室完成，感谢张云、何秋霞等老师的指导和帮助! )
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