2. 徐州医科大学 生理教研室，江苏 徐州 221004;
3. 西南医科大学医学电生理学教育部重点实验室心血管医学研究所，四川 泸州 646000
2. Dept of Physiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou Jiangsu 221004, China;
3. Key Lab of Medical Electrophysiology, Ministry of Education of China, and the Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, Luzhou Sichuan 646000, China
近年来，银杏叶提取物对心脑血管循环系统有改善作用已有较多报道。虽然银杏叶提取物中的活性成分很多，但在拮抗血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)方面，它的活性成分中的银杏内酯A、B、C是PAF天然的特异性拮抗剂[1]。一般缺血预处理只能起到预防作用，而缺血后处理却能起到治疗作用，且药物性缺血后处理，相对于手术的风险小，因而有着更好的临床应用价值。研究发现，银杏内酯A预处理，可改善成年大鼠离体心脏缺血状态[2]，缺血性心肌病是老年人的好发病，目前研究表明，银杏内酯A后处理，对老年大鼠心功能的影响，尤其是对缺血的单个心肌细胞收缩功能的研究甚少。因而，本实验通过使用银杏内酯A后处理的方式，研究其对缺血/再灌注损伤的老年大鼠单个心肌细胞收缩功能的影响，并探究其发挥作用是否与PI3K/Akt信号通路有关。
1 材料与方法 1.1 实验动物正常健康清洁级SD老年大鼠，♂，20~24月龄，体质量(400±50)g，由徐州医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012-0032。
1.2 试剂与仪器银杏内酯A(德国Fluka公司)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中[3]；LY294002(Sigma公司，批号：092M4616V)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；蛋白提取试剂盒、NBT/NCIP显色试剂盒(碧云天生物技术公司)；p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(Cell Signaling公司)；其他试剂均为国产分析纯。Langendorff灌注装置(澳大利亚AD Instrument)；酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.3 分离单个心肌细胞参照实验室常用的方法[3]，SD老年大鼠腹腔注射肝素约10 min后，颈椎脱臼处死，取出心脏置冰浴台氏液中，剪去除主动脉以外心脏周围其他的组织，并把主动脉插入Langendorff灌注架上，用线结扎固定。用无钙台氏液灌5 min，接着改用含0.5 g·L-1 Ⅱ型胶原酶和钙的台氏液循环灌流25 min左右，待心脏变软，迅速剪下左心室部分，置氧饱和的KB液中撕碎，过滤出单个心肌细胞，并让其自然沉降，弃上清，用KB液洗涤沉淀3次后，接种于无血清高糖DMEM中，在12孔板中的浓度为2×104个细胞/孔，于CO2培养箱中正常培养2 h。
1.4 细胞模拟缺血/再灌注模型的制备[3]随机将分离的老年大鼠心肌细胞分为3组，正常对照组(Control组)：心肌细胞在CO2培养箱中正常培养5 h；缺血/再灌注损伤组(I/R组)：即模拟缺血/再灌注损伤，先将老年心肌细胞放置于无糖培养基中，并于三气培养箱(37℃、94% N2、5% CO2和1% O2)培养3 h，之后放入CO2培养箱正常培养基培养2 h视为模拟复灌；银杏内酯A组(GA组)：将模拟缺血3 h后的老年单个心肌细胞放入加有银杏内酯A的正常培养基中，正常培养2 h，GA组又分为5个浓度组(GA 0.1组、GA1组、GA10组、GA30组、GA100组)，其在培养基中的终浓度分别为0.1、1、10、30、100 μmol·L-1。采用盲法在显微镜下计数一定数量的心肌细胞，存活率/%=长杆状细胞数/总细胞数×100%。吸取少量心肌细胞测定其收缩功能，剩下用于测定蛋白含量。
1.5 心肌细胞收缩功能测定[3]吸取少量心肌细胞，滴加在含有2 mmol·L-1钙的KH液恒流(37℃)的细胞浴槽内，并给予0.5 Hz的电刺激。选取细胞膜完好、横纹比较清晰、杆状的心肌细胞(放大400倍)，记录并分析其收缩情况。用Optical Measure软件分析，计算心肌细胞收缩幅度(%)、收缩时间(time-to-peak，TTP)、舒张50%时间(R50)、舒张100%时间(R100)。并确定银杏内酯A的最佳浓度。
1.6 LDH和SOD含量的测定收集各组培养基上清，按试剂盒说明书测定LDH和SOD的释放量，严格按照操作规程，使用酶标仪测定。
1.7 Western blot检测细胞Bcl-2、Bax和p-Akt蛋白的表达由收缩功能确定的银杏内酯A最佳浓度为30 μmol·L-1。LY组：在心肌细胞模拟缺血3 h后，即复灌开始时，细胞培养基中加入终浓度为20 nmol·L-1的LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)。GA+LY组：在复灌时，培养基中加入30 μmol·L-1的银杏内酯A及与LY组相同浓度的LY294002。继续正常培养2 h后，收集细胞，加入裂解液，离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品进行15% SDS-PAGE(10%分离胶，5%浓缩胶)电泳分离，并移至PVDF膜上，封闭2 h后，用p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(1 :1 000)4℃孵育过夜，洗膜，二抗结合2 h，再洗膜，加入显色剂(NBT/NCIP显色试剂盒)，流水洗涤终止反应。内参对照用β-actin(1 :5 000)。定量分析，对照组光密度为1，其余组与其比较。结果重复3次。
1.8 统计学处理使用GraphPad Prism 4.0分析软件，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果 2.1 心肌细胞存活率如Fig 1所示，与Control组比较，其余各组的心肌细胞存活率明显下降(P < 0.01)。但与I/R组相比，银杏内酯A后处理后，能够增加心肌细胞的存活率，在浓度为10、30 μmol·L-1时差异有显著性(P < 0.01)。
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| 图 1 Effect of ginkgolide A post-treatment on viabilityof aged rat cardiomyocytes after I/R culture(x±s, n=10) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs I/R |
Tab 1结果显示，与Control组比较，其余各组细胞培养基中的LDH含量明显增加；与I/R组比较，银杏内酯A后处理以后，GA10、GA30组培养基中的LDH含量明显降低(P < 0.05)。与Control组比较，其余各组的SOD含量明显下降；与I/R组比较，GA10、GA30组培养基中SOD的含量均明显增加(P < 0.01)。
| Group | LDH/U·L-1 | SOD/U·L-1 |
| Control | 53.7±19.6 | 270.7±30.3 |
| I/R | 958.4±72.5** | 114.0±13.1** |
| GA0.1 | 883.6±83.4** | 122.3±15.0** |
| GA1 | 828.4±123.3** | 137.2±10.5** |
| GA10 | 693.6±116.3*## | 161.4±16.3**## |
| GA30 | 799.0±126.7**# | 160.2±10.1**## |
| GA100 | 853.5±96.0** | 137.5±12.8** |
| * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control; # P < 0.05, ## P < 0.01 vs I/R | ||
如Fig 2所示，与Control组比较，其余各组的心肌细胞收缩幅度明显下降；与I/R组比较，银杏内酯A后处理以后，GA10、GA30组心肌细胞的收缩幅度明显增强(P < 0.05)，而银杏内酯A在低浓度和高浓度时，对心肌细胞的收缩幅度没有影响。
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| 图 2 Effect of ginkgolide A post-treatment on myocellular shortening amplitude in aged rats after I/R culture(x±s, n=10) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs I/R |
Tab 2结果显示，与Control组比较，其余各组的TTP都明显延长；与I/R组比较，GA10、GA30组TTP均明显缩短(P < 0.05)。与对照组的R50比较，I/R组的时间明显延长，但与I/R组相比较，GA10组能明显缩短R50(P < 0.05)。而在舒张100%的时间中，各组间差异无显著性。
| Group | TTP | R50 | R100 |
| Control | 135.7±10.9 | 66.9±6.7 | 441.4±16.0 |
| I/R | 179.9±12.1** | 78.4±6.8* | 457.4±14.9 |
| GA0.1 | 175.9±13.1** | 74.1±6.6 | 445.9±18.4 |
| GA1 | 167.5±14.6** | 68.8±7.1 | 446.9±18.4 |
| GA10 | 153.7±12.9*## | 67.8±6.6# | 441.7±21.1 |
| GA30 | 160.4±13.2**# | 71.0±8.4 | 435.6±19.8 |
| GA100 | 166.8±6.5** | 72.7±3.5 | 438.2±17.1 |
| * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control; # P < 0.05, ## P < 0.01 vs I/R | |||
如Fig 3所示，与Control组相比，I/R组心肌细胞中Bcl-2蛋白含量明显下降，而Bax蛋白明显升高。不同浓度的银杏内酯A后处理后，Bcl-2蛋白含量却有不同程度的升高，Bax蛋白表达也有相应的下降，Bax/Bcl-2也明显下降。与I/R组相比，银杏内酯A的浓度在10、30 μmol·L-1时，差异有显著性(P < 0.05)。
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| Fig 3 Ginkgoldie A post-treatment on changes of Bcl-2 and Baxproteins in stimulated ischemia aged rat myocytes(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs I/R |
由Fig 4可看出，每个组Akt总蛋白表达(T-Akt)差异并无显著性。但模拟I/R后，各组细胞中p-Akt蛋白表达升高，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)增强。与Control组和I/R组相比，银杏内酯A明显提高了Akt磷酸化水平。联合用LY294002后，银杏内酯A提高Akt磷酸化水平的作用被部分抑制了(P < 0.05)。提示银杏内酯A后处理的这种保护作用可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。
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| 图 4 Effect of ginkgolide A post-treatment on expression ofp-Akt and Akt proteins in I/R aged rat cardiomyocytes(x±s, n=3) GA group:Cardiomyocytes were cultured with ginkgolide A at 30 μmol·L-1 for 2 h after ischemia stimulation; GB+LY group: Cardiomyocytes were cultured with 20 nmol·L-1 LY294002 and 30 μmol·L-1 ginkgolide A for 2 h after ischemia stimulation; LY group: Cardiomyocytes were cultured with 20 nmol·L-1 LY294002.**P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs I/R; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs GA |
有研究发现，银杏内酯A无论在体内，还是体外都能够通过不同的通路来减弱炎症反应[4-5]，有较好的抗炎作用，并能够抑制各种早期炎症介质。血小板活化因子受体(platelet activating factor receptor，PAFR)是G蛋白偶联受体，它会出现在关键的靶细胞的炎症、免疫和止血过程中。当PAFR与其配体PAF或像PAF一类的脂质结合以后，就会引发各种细胞内的信号级联反应，并诱导一些功能变化，然后启动或放大炎症反应，形成血栓或最终凋亡。在缺血或缺氧组织中，PAF的积累是一个主要的损伤因素，PAF参与了心肌再灌注损伤过程。
研究发现，银杏内酯A后处理以后能够增强老年大鼠心肌细胞的存活率，浓度在10、30 μmol·L-1时能发挥更好的保护作用，证明了银杏内酯A起到了降低细胞损伤的作用。有研究发现[6]，5 μg·L-1的银杏内酯就能够明显降低心肌细胞的死亡率，在缺氧的心肌细胞中PAFR的mRNA表达增加，而银杏内酯却能降低其表达。在缺血阶段，银杏内酯能够调节PAFR以及PAF的乙酰水解酶，抑制和减弱心肌梗死，从而对缺血心脏起到保护作用。银杏内酯A降低老年心肌细胞凋亡是否通过调节PAFR mRNA的表达而起保护作用的，有待进一步研究。
另外，银杏内酯A还降低了培养基中LDH的含量，抑制了SOD活性的下降，说明其可对抗因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，减弱由自由基对细胞造成的伤害。这是由于银杏内酯A具有明显的抗氧化和自由基清除的作用[7]。
本研究结果发现，由于缺血造成的负性肌力作用可以被银杏内酯A后处理抑制，银杏内酯A浓度在10、30 μmol·L-1时能够有效抑制由缺血造成的单个心肌细胞收缩幅度的降低，并呈浓度依赖的方式。心肌细胞的收缩功能受收缩和舒张两方面的影响。研究发现，在缺血/再灌注损伤以后，TTP明显延长，说明缺血/再灌注损伤减弱了心肌细胞的收缩能力。而银杏内酯A后处理以后，明显地缩短了缺血造成的TTP的延长，增强了细胞的收缩力，缩短了R50，使得心肌细胞尽快恢复。但各组间R100没有差异，表明银杏内酯A并不能改变舒张时间，有助于心肌细胞更好地休息。这与之前在离体器官水平上，银杏内酯A预处理改善成年大鼠缺血/再灌注损伤的离体心脏收缩功能[2]的结果相一致。银杏内酯B对缺血后心肌细胞的收缩有改善作用，并减轻再灌注损伤[3]，可能与它调控一些钙调蛋白有关[8]。银杏内酯A后处理减轻老年大鼠的再灌注心肌损伤是否也通过这些机制，有待进一步研究。
研究发现，银杏内酯A后处理能够增加老年大鼠心肌细胞中p-Akt的表达，而LY294002能消弱这种作用，降低Bax/Bcl-2，减少了细胞死亡率。PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化降低后，一些促炎症因子表达会增强，并最终诱导心肌细胞凋亡[9]。Akt一旦被激活，可以使Bcl-2蛋白表达增强，并能够进一步抑制促凋亡蛋白如Bax、Bad、caspase等的形成。Bcl-2家族是PI3K/Akt信号通路的重要靶点，细胞的凋亡取决于Bax/Bcl-2，比值越高死亡率越高[10]。因而，银杏内酯A对老年大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，可能是通过影响PI3K/Akt信号通路，降低细胞凋亡来完成的，与银杏内酯B的作用机制相同[11]，是否可以考虑联合应用两种成分来治疗老年心肌缺血病，或许效果会更佳。
研究结果表明，银杏内酯A后处理对老年大鼠缺血/再灌注损伤造成的单个心肌细胞收缩功能障碍，具有改善作用，能够减少心肌细胞的凋亡，可能是通过PI3K/Akt信号通路完成的。因而，银杏内酯A后处理对老年人的心肌缺血病具有潜在的临床治疗作用。
( 致谢: 感谢徐州医科大学生理功能与损伤实验室为本实验提供的技术支持，感谢付璐、潘秀华老师和侯红件给予实验上的帮助。)
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