2. 蚌埠医学院 药学院，安徽 蚌埠 233030
2. School of Pharmacy, Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233030, China
肿瘤是常见严重危害人类的重大疾病，口腔颌面部恶性肿瘤多为癌，口腔癌约占全身恶性肿瘤的3%~5%[1]。如何有效治疗肿瘤，控制肿瘤的生长，解决化疗后期的耐药问题是肿瘤临床治疗中需要解决的重大难题。有研究报道，非编码RNA可能发挥重要作用，调节不同类型的癌症[2]。microRNA-17的变化与口腔癌临床病理及淋巴结转移息息相关，引起我们关注[3]。本实验以口腔肿瘤人舌鳞癌TCA811和KB细胞为研究对象，探讨microRN-17与奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)对口腔癌细胞凋亡的影响，为口腔肿瘤的诊治提供参考和借鉴。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人舌鳞状细胞癌TCA8113，购自中科院细胞库；人口腔癌KB细胞株，购自由上海细胞库，于蚌埠医学院生化药理实验室冷冻保存。
1.1.2 试剂DAPI购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基、MEM培养基，购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot一抗稀释液、蛋白预染Marker、细胞裂解液、噻唑蓝(MTT)，均购自碧云天公司；转染试剂和microRNA-17抑制剂购自上海吉玛制药技术有限公司；奥沙利铂为齐鲁制药有限公司产品；兔抗人β-actin、Bax、Bcl-2、Mcl-1抗体，购自Proteintech公司。
1.1.3 仪器恒温培养箱(美国热电公司)；净化工作台(苏州泰安空气技术公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；Mini-Prote电泳仪(美国伯乐公司)；高速冷冻离心机(意大利ALC公司)；Milli-Q Biocel超纯水仪(美国Millipore公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人舌鳞癌TCA8113采用RPMI 1640培养液，含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素。口腔上皮癌KB细胞采用MEM培养基，含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素。细胞在37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 MTT法检测细胞存活率每孔加入100 μL细胞培养液，其中含有对数期细胞8 000个，并设置3个复孔，每孔加入不同浓度的药物作为对照。在37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中待细胞贴壁后，加药处理各组。实验设空白对照组(不加细胞)、只含细胞的阴性对照组和不同处理组，按照实验设计处理细胞一定时间。每孔加入浓度为5 g·L-1的MTT溶液15 μL，置于37℃的恒温条件下孵育4 h，去除上清液后，再向反应孔中滴加150 μL DMSO，置于37℃的恒温条件下孵育0.5 h，在490 nm波长处用酶联免疫检测仪测每孔OD值，计算细胞存活率：细胞存活率=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。
1.2.3 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞凋亡JC-1染色工作液按照试剂盒操作说明书比例配制，放置于冰上备用；取对数生长期细胞，接种于6孔板，每孔2×105个细胞，培养过夜。待细胞完全贴壁并长至80%融合后，分组处理。随后向孔板内加入1 mL JC-1染色工作液，并振荡混匀，置于37℃的恒温细胞培养箱中孵育20 min。在孵育期间，取适量JC-1染色缓冲液(5×)，按照1 :4的比例配制JC-1染色缓冲液(1×)，并置于冰浴条件下处理。孵育结束后去除上层清液，并用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤细胞2次。随后将细胞置入JC-1染色缓冲液中制成细胞悬浊液后，置于光学显微镜下观察。
1.2.4 DAPI染色处于对数生长期的口腔癌细胞接种于6孔细胞培养板，处理组刺激细胞24 h，弃去细胞培养基，用PBS洗涤细胞2次，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗细胞3次，加入DAPI，置于避光室温环境下染色处理10 min，随后用PBS溶液洗涤，荧光显微镜下观察，并拍照观察细胞核凋亡情况。
1.2.5 microRNA瞬时转染调整细胞密度为2×108·L-1，接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合度为30%~50%时进行转染，具体步骤参考脂质体LipofectamineTM2000说明书：(1)分别将转染物、Lipofectamine2000脂质体与Opti-MEM培养基按照1 :50的比例混匀，静置5 min，随后将两种混合液体混匀，静置20 min即获得转染复合物，随后将混匀物转移至特殊培养皿中(无抗生素、无血清)培养6 h，再移至10%小牛血清培养皿中继续培养(无抗生素)，获得的细胞备用。
1.2.6 Western blot检测取对数生长期的人口腔癌细胞接种于6孔板，培养24 h加入药物处理，随后收集各组细胞，并用细胞裂解液处理，提取细胞总蛋白，检测总蛋白含量；与5×上样缓冲液1 :4混合，96℃煮沸5 min蛋白变性，采用凝胶电泳分离获取蛋白后，将其转移至PVDF膜上，随后用5%脱脂牛奶处理2 h；一抗处理2 h或置于4℃恒温条件下过夜，TBST反复洗膜3次，每次5 min；二抗处理2 h，TBST反复洗膜3次，每次5 min，使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate试剂盒，凝胶成像系统获取图像，实验重复3次。
1.2.7 统计学分析计量资料以x±s表示，用SPSS统计学软件进行数据处理和分析，组间数据比较采用独立t检验。
2 结果 2.1 下调mircoRNA-17增强奥沙利铂对口腔癌细胞增殖的抑制作用如Fig 1所示，单独使用OXA或转染miR-17抑制剂均可抑制TCA8113、KB细胞增殖。单独下调microRNA-17作用TCA8113细胞24 h时，能够抑制口腔肿瘤细胞的活力。2 μmol·L-1奥沙利铂作用于TCA8113、KB细胞24 h后，细胞存活率为69.99%、60.77%；下调mircoRNA-17后与2 μmol·L-1奥沙利铂联合作用24 h后，细胞存活率为51.26%、39.27%。提示下调mircoRNA-17能增强奥沙利铂对口腔癌细胞增殖的抑制作用，结果有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 1 Effects of OXA on the viability of oral cancer cells after down-regulation of mircoRNA-17(x±s, n=3) A: TCA8113 cells; B: KB cells. *P < 0.05 vs OXA group. |
研究发现，线粒体膜电位的变化能够反映细胞凋亡与否，若膜电位持续降低则提示细胞可能进入了凋亡早期，此时细胞内的JC-1在线粒体基质内无法形成聚合体，故主要以单体形式存在，荧光标记时呈绿色；而当线粒体膜电位较高时，细胞内的JC-1会在线粒体基质内形成聚合体，荧光标记时呈红色。下调mircoRNA-17后，与对照组相比，2 μmol·L-1奥沙利铂作用于口腔细胞24 h后，红色荧光呈现减弱趋势，绿色荧光呈现增强趋势(Fig 2)。提示下调mircoRNA-17能够增强奥沙利铂诱导口腔癌细胞早期凋亡的作用。
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| Fig 2 Effect of OXA and down- regulation of microRNA-17 on mitochondrial membrane potential in oral cancer cells(JC-1 staining×200) A:TCA8113 cells; B:KB cells. |
转染mircoRNA-17抑制剂, 与奥沙利铂共同作用24 h，DAPI染色观察细胞核的凋亡情况。Fig 3结果表明，对照组细胞的胞核呈圆形，均一蓝染，下调mircoRNA-17与2 μmol·L-1奥沙利铂作用24 h后，细胞核出现典型的凋亡形态改变，主要表现为核浓缩、细胞核碎裂，说明抑制细胞内microRNA-17表达可增强奥沙利铂诱导两种口腔肿瘤细胞凋亡的作用。
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| Fig 3 Cell nuclear morphology observed after DAPI staining(×200) A:TCA8113 cells; B:KB cells. The arrow in the diagram shows the nuclear enrichment and nuclear fragmentation. |
下调mircoRNA-17表达，并采用2 μmol·L-1奥沙利铂作用于口腔癌细胞24 h，Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2、Mcl-1的表达。如Fig 4所示，抑制细胞凋亡的Bcl-2表达降低，而促进细胞凋亡的Bax、Mcl-1表达明显增高，这些细胞因子共同诱导口腔肿瘤细胞凋亡。
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| Fig 4 Effects of down-regulation of mircoRNA-17 on expression of Bax, Bcl-2 and Mcl-1(x±s, n=3) *P < 0.05 vs control |
铂类抗癌药物是治疗口腔肿瘤的常用药物，奥沙利铂为第3代铂类药物，相对于顺铂及卡铂毒副作用较小，广泛应用于消化道肿瘤。奥沙利铂活化后，DACH环和癌细胞的DNA结合，阻肿瘤细胞中DNA复制、转录，使细胞发生周期性非特异性死亡[4]。化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤主要手段之一，铂类药物是临床上最常用的周期非特异性抗肿瘤药物，在临床治疗实体肿瘤中显示了良好的疗效，然而，铂类抗肿瘤药物结构上的相似性，使得耐药性或交叉耐药性成为限制该类药物临床应用的主要障碍之一[5]。因此，当前肿瘤研究的重点主要集中在如何降低耐药性，提高放化疗敏感性，实现靶向治疗方面[6]。寻找如何提高化疗药物敏感性的途径，是目前尚需解决的难题。
microRNAs(miRNAs)是一种短(20~24 nt)的非编码RNA，它能够介导基因的表达，调控转录水平，进而影响mRNA的翻译过程。平均每个miRNAs可以调节100~200个靶基因，它们基本上涉及所有生物学过程。近年来，非编码RNA在肿瘤中发挥着抑癌基因和(或)癌基因被认为是肿瘤发展的主要驱动力[7]。近期研究表明，mircoRNA-17在临床中与口腔癌TNM分期及淋巴结转移存在负相关。提示口腔肿瘤细胞可能通过下调mircoRNA-17的表达，对口腔癌的发生发展起到重要作用。microRNA-17属于miR-17-92族，其基因序列和组成在脊椎动物中高度保守，但是在不同组织中表达水平不同，在某些细胞系中可加快或是延缓细胞由G1期进入S期，在不同的肿瘤组织中可能发挥着癌基因或是抑癌基因的作用，取决于肿瘤的类型[8-10]。从上述实验中可以看出，下调mircoRNA-17可增强奥沙利铂对口腔癌细胞增殖的抑制作用，通过对microRNA的调控增强化疗药物敏感性引起我们的关注。
Mcl-1是1993年在白细胞系中首次被发现[11]，其可促进细胞凋亡，提高药物对肿瘤的治疗作用。Bcl-2家族蛋白也是细胞凋亡的关键调节分子，作用于线粒体发挥相应功能[12-13]，可抑制多种细胞凋亡。本实验中，通过检测线粒体膜电位，红、绿荧光对比发现，下调mircoRNA-17可增加奥沙利铂诱导的口腔癌细胞凋亡，降低Bcl-2表达，促进Mcl-1、Bax高表达，促进肿瘤细胞凋亡。
综上所述，下调mircoRNA-17可增强奥沙利铂对TCA8113、KB细胞增殖的抑制作用，也能够增强奥沙利铂对口腔癌细胞的诱导凋亡作用。本研究从mircoRNA的角度探究增强口腔肿瘤细胞化疗敏感性的机制，为治疗口腔肿瘤提供了新思路。
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