雷公藤甲素(triptolide, TP)是中药雷公藤的主要活性成分，属于环氧化二萜内酯类化合物，具有免疫抑制、抗炎、抗癌、抗生育、神经保护等药理作用^[1-2]，临床用于治疗红斑狼疮、银屑病等免疫性疾病^[3]。雷公藤是已知的有毒中药，临床主要导致剂量依赖的肝毒性^[4]。国家药品不良反应监测中心病例报告数据库中，涉及雷公藤制剂不良反应的病例报告主要表现之一为药物性肝炎，毒性表现与急性黄疽型肝炎相似，常见谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)等指标升高，甚至有因肝毒性过大而致死的病例报道^[5]。TP是雷公藤的主要药效成分，也是引起肝毒性的毒性成分，在人L-02细胞和大鼠原代肝细胞上表现为时间和剂量依赖的毒性^[6-7]；不同性别大鼠长期给药能引起不同程度的肝损伤^[8]。

TP主要经细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)酶代谢消除，CYP3A介导的代谢是TP的解毒途径之一^[9]，肝脏对TP的代谢能力与肝毒性紧密相关。CYP酶基因敲除、CYP酶广谱抑制剂1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole, ABT)预处理，以及谷胱甘肽耗竭均能降低TP代谢，增强其肝毒性；而合用地塞米松、甘草甜素等CYP酶诱导剂，能减轻TP的大鼠肝毒性^[10]。已有的TP肝毒性和代谢研究主要在大鼠上进行，但TP在人和大鼠肝代谢的差异尚无报道。为此，本文应用人肝微粒体(human liver microsomes, HLM)和大鼠肝微粒体(rat liver microsomes, RLM)，研究TP在两个种属的代谢消除性质和酶动力学特征，比较种属间差异；并采用重组的人和大鼠CYP3A酶，探讨TP肝脏代谢消除种属差异的可能原因，为TP代谢与肝毒性关系研究和动物结果向人体的外推，提供科学依据。

TP，纯度99.78%(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-17020405)；还原性辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)，购自瑞士Roche公司；混合人肝微粒体和重组CYP3A酶(美国BD Gentest公司)；色谱纯甲醇和乙腈(美国Fisher公司)；大鼠肝微粒体为实验室自制，BCA法测得蛋白含量为15 g·L^-1。

6410B三重四级杆串联质谱(美国Agilent公司)，配备Agilent1290超高压液相色谱(UHPLC)和美国安捷伦公司Zorbax SB-C18(2.1 mm×50 mm, 3.5 μm)色谱柱。

孵育体系为200 μL的K₂HPO₄缓冲液(100 mmol·L^-1, pH 7.4，含5 mol·L^-1氯化镁)，内含TP(1 μmol·L^-1)、HLM(蛋白含量1.0 g·L^-1)或RLM(蛋白含量0.5 g·L^-1)和NADPH(1 mmol·L^-1)，每组设3个平行样品。将肝微粒体与药物的混合溶液和NADPH分别在37℃预孵育5 min后，加入NADPH启动反应，并继续在37℃孵育，于5、15、30、45、60 min取样，加入600 μL含内标(普萘洛尔100 μg·L^-1)的乙腈终止反应，涡旋振荡1 min，18 800×g离心10 min，取上清液至LC-MS/MS检测TP的剩余浓度。孵育实验平行设置不加辅酶的空白对照组、零时反应组和加入咪达唑仑的阳性对照组。

将不同浓度药物加入上述孵育体系孵育，TP的终浓度分别为0.5、1、2、4、10、25、50、100 μmol·L^-1。根据代谢稳定性实验结果，设置HLM组和RLM组的反应时间分别为45 min和5 min，同时设置零时对照组。孵育终点加入600 μL含内标的乙腈终止反应，涡旋振荡1 min，18 800×g离心10 min，取上清液至LC-MS/MS检测TP的剩余浓度。

在大鼠源重组CYP3A1和CYP3A2同工酶孵育体系(蛋白含量1 μmol·L^-1)，加入终浓度为0.5、1、2、4、10、25 μmol·L^-1的TP，NADPH(1 mmol·L^-1)，37℃孵育5 min；在人源重组CYP3A4的孵育体系中(蛋白含量1 μmol·L^-1)，加入终浓度为0.5、1、2、4、10、25、50 μmol·L^-1的TP，同法孵育45 min。孵育终点加入600 μL含内标的乙腈终止反应，涡旋振荡1 min，18 800×g离心10 min，取上清液至LC-MS/MS检测TP的剩余浓度。

应用本课题组前期建立并验证的液质联用方法检测样品^[9]。液相条件：以流动相A(含体积分数为0.1%甲酸和2.5 mmol·L^-1甲酸铵的纯水)和B(含体积分数为0.1%甲酸的乙腈)按如下梯度洗脱：30% B(0 min)，80% B(0~1 min)，95% B(1~2 min)，30% B(2.1 min)，30% B(2.1~3.1 min)；流速为3 mL·min^-1，运行时间为3.1 min。内标为普萘洛尔。质谱条件：以电喷雾电离(ESI)源正离子多反应监测方式检测，毛细管温度350℃，毛细管电压+4 000 V，雾化气25 psi，干燥气流速10 L·min^-1，TP的检测离子对为m/z 378.1→361.1，内标为m/z 260.0→116.2。TP在定量范围(10~10 000 nmol·L^-1)内，线性良好(线性相关系数R2＞0.9900)，定量下限为10 nmol·L^-1，在低、中、高3个浓度下的批内和批间相对标准偏差(RSD)值均＜10%，准确度的RE值均在±15%内，提取回收率均＞90%。方法满足本研究要求。

将零时组药物浓度作为100%，由孵育一定时间后的剩余浓度与零时浓度相比，得到原药的剩余百分比。各时间点原药的剩余百分比经自然对数转换后，与相应的孵育时间作图，通过线性回归求得斜率(k)，由公式1求得药物肝微粒体代谢消除半衰期(min)；应用基于Well Stirred Model的公式2^[11]，得到药物在HLM和RLM的内在清除率CL_int(mL·min^-1·kg^-1)；应用公式3，对肝微粒体的数据进行外推，得到肝清除率CL_h(mL·min^-1·kg^-1)。相关动物理化参数的经验值引自文献^[12]。

(1)

(2)

(3)

(4)

以TP的浓度为横坐标，其消除速率为纵坐标，应用Graphpad Prism 5软件绘制曲线，得到TP在肝微粒体和重组酶的表观酶动力学参数K_m和最大反应速度V_max，由酶动力学参数经公式4计算得到内在清除率(CL_int, E)。

应用Microsoft Excel进行数据和统计学检验分析，采用成组t检验比较组间差异。

TP在肝微粒体的Ⅰ相代谢依赖辅酶NADPH，在未添加NADPH的情况下，TP未发生明显消除。TP在肝微粒体的代谢消除动力学曲线见Fig 1，计算得到的TP在肝微粒体的消除半衰期和内在清除率CL_int，外推得到的肝清除率CL_h(Tab 1)。TP在1.0 g·L^-1HLM和0.5 g·L^-1RLM孵育液中分别孵育45、5 min，原药消除约为20%；孵育60 min的代谢消除率分别为24.7%和87.7%，有明显差异。由Tab 1可见，TP在HLM和RLM的分别为154、19.9 min(P < 0.01)，CL_int和CL_h差异均有显著性(P < 0.01)，表明TP的肝微粒体代谢消除存在明显的种属差异。

Fig 1 Metabolic elimination of TP in HLM or RLM(x±s, n=3) *P < 0.05 vs HLM

图选项

Tab 1 Metabolic clearance parameters of TP in HLM or RLM(x±s, n=3)

	/min	CLint /mL·min-1·kg-1	CLh /mL·min-1·kg-1
HLM	154.4±9.35	5.6±0.33	4.4±0.21
RLM	19.9±0.09**	87.2±0.38**	16.7±0.01**
RRLM/HLM	0.13	15.5	3.8
**P < 0.01 vs HLM

表选项

采用底物消除法，考察TP在HLM和RLM的酶促动力学。通过酶蛋白浓度和孵育时间的预实验，确定RLM和HLM的孵育时间分别为5 min和45 min(原药消除约20%)；RLM和HLM蛋白浓度分别为0.5、1 g·L^-1。应用非线性回归分析方法，拟合TP在人和大鼠肝微粒体的酶动力学曲线，见Fig 2，得到的参数列于Tab 2中。TP在RLM的表观K_m和V_max分别为18.4 μmol·L^-1和2 194 pmol·min^-1·mg^-1，与文献报道结果相符^[10]。TP与HLM的表观亲和力(K_m =11.2 μmol·L^-1)与RLM(K_m =18.4 μmol·L^-1)相比，有统计学差异(P < 0.05)，但大鼠的最大反应速率V_max(139 pmol·min^-1·mg^-1)远高于HLM(P < 0.01)；由酶动力学参数得到的两个种属的CL_int, E，HLM也明显低于RLM(P < 0.01)。

Fig 2 Reaction rate-substrate concentration curvesof TP in HLM (A) or RLM (B)(x±s, n=3)

图选项

为了探讨TP人和大鼠肝代谢消除种属差异的可能原因，本研究进一步采用人重组CYP3A4和大鼠重组CYP3A1、3A2同工酶与TP孵育，比较TP在不同CYP3A亚型的酶反应动力学参数。CYP3A4、3A1、3A2的酶动力学曲线见Fig 3，计算得到的酶动力学参数见Tab 3。结果显示，TP在人和大鼠CYP同工酶的亲和力和反应速率差异均具有显著性。TP与大鼠CYP3A1和CYP3A2酶的亲和力明显高于人源CYP3A4酶(P < 0.05)；在CYP3A1和CYP3A2酶中的反应速率V_max也更高(P < 0.01，P < 0.05)。由此得到的内在清除率CL_int差异也具有显著性。

Fig 3 Reaction rate-substrate concentration curves of TP in supersomes CYP3A4 (A), 3A1 (B) or 3A2 (C)(x±s, n=3)

图选项

CYP介导的代谢是TP在肝脏的重要解毒途径^[9]。TP在肝脏的代谢消除动力学以及与肝脏CYP酶的酶动力学性质，是比较不同种属肝脏对TP的解毒能力的关键指标，也是实验动物肝代谢与毒理学评价结果向人体外推的重要前提。为此，本研究首先在肝微粒体孵育体系中比较了人与大鼠对TP代谢消除的差异。在0.5 g·L^-1的RLM中，TP代谢较快，60 min内代谢消除了87.7%；但在同样蛋白浓度的HLM，TP仅有很少量的代谢(＜8%)。将HLM的蛋白浓度提高到1 g·L^-1，TP在60 min内的代谢消除仍不到25%，两个种属之间差异有显著性。酶动力学的结果显示，TP与两个种属肝微粒体的表观亲和力稍有差别(1.7倍)，但RLM的表观反应速率是HLM的15.8倍，二者有很大的差异，使得TP在两个种属肝微粒体中代谢消除动力学和清除率差异有显著性。

TP在肝微粒体的代谢消除是由多个CYP酶亚型介导的，CYP3A是其主要代谢酶表型^[13]。我们的前期研究显示，人CYP3A4酶对TP代谢的贡献率为35%。由于人和大鼠肝脏的CYP3A同工酶亚型和丰度存在差异。人CYP3A包括CYP3A4、3A5、3A7、3A43，其中CYP3A4是成人肝脏主要表达和参与代谢的亚型；大鼠CYP3A亚型包括CYP3A1、3A2、3A9、3A18等亚型，其中CYP3A1/2所占比重最大^[14]。为此，我们用重组CYP3A同工酶，进一步比较研究了TP在人CYP3A4和大鼠CYP3A1/2酶孵育体系的酶反应动力学。结果显示，TP与CYP3A1的亲和力最高，其次是3A2；CYP3A1和3A2的V_max分别是CYP3A4的5.7和4.7倍。TP与人和大鼠CYP3A亚型的亲和力及反应速率差异具有显著性，可能是其在RLM代谢清除明显快于HLM的主要原因之一。

尽管TP在大鼠肝脏的代谢消除较快，但TP长期或高剂量给药仍可导致大鼠严重肝损伤，甚至死亡^[8]。本文采用充分搅拌模型(Well Stirred Model)外推公式(2和3)^[11]，对肝微粒体实验得到的内在清除率进行体外-体内外推，得到大鼠和人的肝清除率CL_h分别为(16.7±0.01)、(4.43±0.21)mL·min^-1·kg^-1, 外推得到大鼠的肝清除率约为人肝清除率的3.8倍，提示TP在人肝的代谢消除明显慢于大鼠。已有的研究表明，TP在体内主要经代谢转化消除，尿粪累积排泄率为67.5%^[15]。由此可以预测，临床应用时由于人体的TP代谢清除率较低，药物对人肝的毒性和损伤可能会更为严重。由于TP在临床上治疗免疫性疾病时多为长期给药，并有可能与其它药物联合应用，因此，临床应用时最好定期检查患者的肝脏功能，必要时调整剂量，并避免将TP与CYP3A抑制剂合用。

本研究结果显示，TP在大鼠和人肝的代谢清除存在明显差异，提示在将TP的大鼠毒性实验结果外推至人时，应考虑到人和大鼠之间在代谢解毒能力上的种属差异。此外，本研究得到的大鼠和人肝微粒体代谢清除和酶动力学数据，可以进一步用于构建基于生理模型的药代动力学模型，更为准确地预测TP在人体的药代动力学和代谢清除。