2. 武汉市第三医院心内科，湖北 武汉 430000;
3. 江西省人民医院心内科，江西 南昌 330006
2. Dept of Cardiology, the Third Hospital of Wuhan, Wuhan 430000, China;
3. Dept of Cardiology, Provincial People's Hospital, Nanchang 330006, China
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由Rubler等[1]在1972年提出的概念，其典型的结构改变是心肌肥厚及心肌纤维化，早期心脏舒张功能受损明显，晚期收缩功能受损导致心力衰竭。DCM发病机制仍不甚明确，因此有必要深入探究其发病机制，为临床治疗提供理论基础。脂肪因子vaspin被认为是心血管保护因子，可抑制炎症通路，延缓动脉粥样硬化的进展，但其在DCM中的作用仍不清楚。本研究建立DCM模型，在体内探讨vaspin是否能改善DCM大鼠心肌纤维化，提高心功能，为治疗DCM提供新的方式。
1 材料与方法 1.1 实验动物10周龄♂SD大鼠36只，体质量(200±20)g，购于南昌大学医学部动物实验中心，使用许可证号：SYXK(赣)2015-0001。普通饲料购于南昌大学医学部动物实验中心。
1.2 试剂链脲霉素(streptozocin，STZ)、水合氯醛、Masson染色试剂盒，均购于北京索莱宝生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)ELISA试剂盒购于上海研域化学试剂有限公司; β-actin、GAPDH抗体购于中杉金桥公司；LC3、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax抗体，购于Cell Signaling Technology公司；TGF-β1、Collagen Ⅰ抗体购于Abcam公司。
1.3 动物模型的建立及实验分组SD大鼠一次性腹腔注射STZ(60 mg·kg-1)，2周后，大鼠尾静脉采血检测血糖，血糖高于16.7 mmol·L-1，表示糖尿病模型建模成功。实验分为以下3组，每组12只大鼠：⑴对照组：正常饲养，腹腔注射生理盐水(0.5 mL·kg-1·d-1)；⑵DCM组：糖尿病模型成功后，腹腔注射生理盐水(0.5 mL·kg-1·d-1)，继续喂养12周, 糖尿病大鼠出现感染，死亡2只；⑶ Vaspin组：糖尿病模型成功后，腹腔注射vaspin(320 ng·kg-1·d-1)，继续喂养12周。
1.4 大鼠空腹血糖检测在实验前1 d禁食12 h，期间保持正常的饮水，用75%酒精棉球消毒大鼠尾部，用剪刀剪去少许末端，轻轻挤压，第1滴弃之，第2滴滴于血糖仪上，测得的血糖值即为空腹血糖值。
1.5 大鼠心脏彩超测定10%水合氯醛麻醉大鼠，用脱毛膏褪去心前区毛发，将大鼠仰卧固定于操作板上，30 MHz频率探头在左室乳头肌水平二维左室短轴切面测量左室舒张末径(LVIDd)、左室收缩末径(LVIDs)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、E峰/A峰(Em/Am)，评估大鼠的心功能。
1.6 ELISA检测实验末，从大鼠的颈静脉窦抽血，3 000 r·min-1离心5 min，取上清，按试剂盒说明书检测TNF-α浓度。
1.7 心肌组织病理标本制作实验末，10%水合氯醛麻醉大鼠后，取出心脏，小心去除临近大血管，用预冷PBS冲洗后，按冠状水平将左心室平均切成两部分，一部分-80℃保存，用于蛋白检测备用，另一部分置于10%中性福尔马林溶液中室温下固定。脱水处理后，石蜡包埋切片，切成4 μm薄片，脱蜡后行Masson染色。
1.8 Western blot检测剪取各组大鼠心脏组织，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度后，取20 μg蛋白量上样电泳，转膜、封闭，加相应一抗4℃孵育过夜，再用HRP标记的二抗孵育2 h。PBST洗膜3次，ECL化学发光液曝光，显影及定影后，用Image J分析软件，测得蛋白条带灰度值，并进行统计分析。
1.9 统计学分析数据分析及绘制统计图表均采用GraphPad prism 6.0统计软件，数据用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析或T检验。
2 结果 2.1 各组大鼠体质量及空腹血糖的变化如Fig 1所示，糖尿病大鼠出现体质量下降，空腹血糖升高(P < 0.01)。相比于DCM组，vaspin处理会增加大鼠体质量，降低大鼠空腹血糖(P < 0.01)，说明vaspin可改善糖尿病大鼠高血糖水平。
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| Fig 1 Changes of body weight and fasting blood glucose in each group (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM |
如Fig 2所示，与对照组相比，DCM大鼠血清中TNF-α水平升高(P < 0.01), 而vaspin对TNF-α水平无明显影响(P > 0.05)。
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| Fig 2 Changes of serum TNF-α in each group (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control |
如Fig 3所示，与对照组相比，DCM大鼠LVEF、FS、Em/Am降低(P < 0.01)，vaspin处理提高了大鼠LVEF、FS、Em/Am(P < 0.01)，说明vaspin可改善DCM大鼠舒张及收缩功能。
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| Fig 3 Effect of vaspin on cardiac function in rats with diabetic cardiomyopathy (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs DCM |
如Fig 4所示，与对照组相比，DCM大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的表达降低，p62表达升高(P < 0.01)。Vaspin处理可以提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1表达，降低p62表达(P < 0.01)，提示vaspin可提高DCM大鼠心肌组织自噬水平。
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| Fig 4 Expression of LC3, Beclin-1 and P62 in each group (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM |
如Fig 5所示，与对照组相比，DCM大鼠心肌组织中Bax表达升高，Bcl-2表达降低, Bax/Bcl-2比值升高(P < 0.01)。Vaspin处理可以减少Bax表达，增加Bcl-2表达，降低Bax/Bcl-2比值(P < 0.01)，提示vaspin可减少DCM大鼠心肌组织的凋亡。
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| Fig 5 Expression of Bax, Bcl-2 in each group (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM |
Fig 6的Masson染色显示，相比于DCM组，vaspin组心肌胶原沉积减少(P < 0.05)；Western blot结果显示，与DCM组相比，vaspin组的Ⅰ型胶原蛋白表达减少(P < 0.01)，而TGF-β1的表达无明显变化(P > 0.05)，说明vaspin是通过减少Ⅰ型胶原蛋白沉积，抑制心肌纤维化，并非通过TGF-β信号转导通路干预心肌纤维化。
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| Fig 6 Effect of vaspin on myocardial fibrosis A: The expression of Collagen Ⅰ and TGF-β1 in each group; B: Masson staining (×200); C: Myocardial fibrosis collagen volume fraction (CVF) analysis. **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs DCM. |
在本研究中，我们成功构建了DCM大鼠模型，与大多数研究不同的是，我们采用STZ(60 mg·kg-1)一次性腹腔注射，继以普通饲料喂养2周后，血糖明显升高，出现多饮、多食、多尿，并伴体质量明显下降，并在造模后12周进行验证，证实出现心肌纤维化和心肌肥厚的糖尿病性心肌病状态，说明这种方式可以稳定地建立DCM模型。由于我们没有用高脂饲料喂养，本方法具有安全、可靠、可行性强、方便快捷的优点，我们的动物模型机制上是利用STZ破坏大鼠胰岛β细胞，造成胰岛素分泌障碍，因此，考虑我们的模型属于1型糖尿病心肌病模型。
Vaspin是2005年新研究发现的脂肪因子，总体上讲，其在心血管疾病中是有利的脂肪因子。Vaspin不仅在脂肪组织、胃、胰腺、肝脏、血管外膜周围脂肪中有表达，而且在心外膜脂肪组织也有不同程度的表达，且由于心外膜脂肪组织、血管壁和心肌之间没有纤维、筋膜层，所以vaspin可直接作用于整个心脏。Vaspin mRNA在肥胖糖尿病人群中高表达，糖尿病患者血清vaspin浓度明显高于非糖尿病人[2]，当糖尿病患者合并心血管病变时，血清vaspin浓度降低[3-4]，提示vaspin可作为糖尿病进展为糖尿病心血管损伤的敏感标记物。进一步研究提示，vaspin的降低是一种失代偿机制，具体的vaspin降低机制仍不是很明确，但是体外实验提高vaspin的水平，可表现出多种保护作用机制。Qi等[5]的研究指出，vaspin可抑制低密度脂蛋白，诱导肺动脉内皮细胞的炎症、凋亡、氧化应激；Sun等[6]的研究结果表明，vaspin通过PI3K/Akt/eNOS途径，调节内皮祖细胞中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表达和功能，可能对糖尿病患者有保护作用，以防止血管并发症的发生。Vaspin还可通过抑制内质网应激诱导的巨噬细胞凋亡，来延缓小鼠动脉粥样硬化斑块的进展[7]。本研究也发现，vaspin可减少糖尿病大鼠心肌凋亡，改善心功能。另外，我们研究还发现，糖尿病大鼠心肌组织中，除了凋亡蛋白增多外，心肌组织中自噬明显下调，vaspin的干预提高了自噬水平，减少了心肌胶原沉积，改善心肌纤维化。
自噬与DCM心肌纤维化密切相关。Xu等[8]利用STZ诱导1型糖尿病模型，发现小鼠心肌组织中自噬水平降低，与我们的实验结果一致。他们在OVE26转基因小鼠中，分别沉默Beclin-1单倍体或ATG16基因后，心肌纤维化和细胞凋亡水平明显降低，外源性给予Beclin-1后，小鼠心肌纤维化及细胞凋亡程度加重，说明提高自噬水平，心肌纤维化及细胞凋亡程度越严重，1型糖尿病心肌病自噬水平降低是应激性保护。相反，Xie等[9]在OVE26小鼠(1型糖尿病)中发现，AMPK的减少总是伴有自噬活性的降低，通过激活AMPK通路可增加糖尿病小鼠自噬水平，改善DCM心肌结构改变，他们的研究结果和我们一致。在本实验中，vaspin提高了自噬水平，减少了心肌细胞凋亡和纤维化程度，但是我们没有探讨自噬与心肌纤维化之间的因果关系，vaspin可能是通过促进自噬，改善心肌纤维化及凋亡，也可能存在自噬以外的其他途径，参与心肌纤维化及凋亡的调节，仍需进一步研究证实，但是至少说明提高自噬并没有加重糖尿病心肌损伤，这一点与Xu等[8]的研究结果相反。之所以存在上述差异，可能与糖尿病动物模型建立的差异有关。我们建立的1型糖尿病心肌病模型中自噬是降低的，而且心肌纤维化明显，与目前众多的研究一致[10]。在目前研究中，1型糖尿病中自噬是被抑制的，然而自噬抑制是应激性保护作用，还是失代偿作用，仍存在分歧，如Xu等[8]的研究提示提高自噬不利于心肌正常功能，而我们的研究和Xie等[9]的研究说明提高自噬可以保护心肌。而在2型糖尿病研究中自噬上调的居多，在2型糖尿病早期会有自噬下调，促进自噬有心肌保护作用[11-12]。
Vaspin可通过PI3K/Akt信号通路，改善内皮祖细胞功能[6]，而PI3K/Akt激活可抑制mTOR，促进自噬，并且PI3K/Akt信号通路也可参与心肌纤维化的调控。我们进一步推测，vaspin对DCM中自噬的调节可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关，我们团队将利用心肌细胞在机制层面进一步深入研究。
综上所述，既然vaspin可调节心肌细胞自噬，而自噬在心肌肥大[13]、氧化应激损伤[14]、胰岛素抵抗[15]、晚期糖基化产物[16]等多方面均有重要调节作用，这些因素与DCM密切相关，说明vaspin可通过调节心肌细胞自噬，参与多种途径影响DCM的发生发展，甚至参与调控其他心血管疾病。因此，调控vaspin可能成为心血管疾病重要治疗策略。
( 致谢: 本实验在江西省高血压研究所完成，在此感谢张婉老师及曾俊义老师在实验中给予的帮助与支持。)
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