表1(Table 1)
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是临床常见的危重病，临床表现为呼吸窘迫、顽固性低氧血症以及呼吸衰竭，其发病机制错综复杂，仍未完全阐明。虽诊疗技术日益提高，但ARDS患者的病死率仍居高不下[1-2]。目前认为，级联性炎症反应爆发、肺微血管内皮细胞及屏障损伤导致的通透性肺水肿，是ARDS发生、发展中的重要环节[3]。因此，如何抑制炎症及减轻肺微血管内皮损伤，对ARDS的治疗及预后有重要意义。
枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是由我国传统中药枸杞提取的一种水溶性多糖，该多糖被明确为蛋白多糖，由木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖及阿拉伯糖组成，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、调节免疫等作用[4]。有研究表明，LBP可通过调控PI3K/Akt/eNOS通路，对大鼠心肌发挥保护性作用[5]。我们前期实验证实，Akt/eNOS信号通路参与介导小鼠ARDS肺血管内皮屏障保护效应[3]，但目前国内外尚无LBP与ARDS的关联报道。本研究旨在通过构建脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)致ARDS小鼠模型，探讨LBP介导的Akt/eNOS信号通路对小鼠ARDS的保护作用及可能机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物32只6~8周龄SPF级C57BL/6小鼠，♂，体质量(20.0±2.0)g，由重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0001。饲养于重庆医科大学动物实验中心，动物研究方案由重庆医科大学附属第二医院伦理委员会审核批准。
1.2 试剂LBP(Solarbio公司，纯度≥90%，批号：SP9311);LPS来源Escherichia coli 055:B5(Solarbio公司，批号：L8880);LY294002(Selleck公司，批号：S1105);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术有限公司); 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)及白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA试剂盒(联科生物有限公司); 丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色FITC标记荧光检测法，通用型)购自凯基生物技术有限公司; β-actin、Akt、p-Akt抗体(Bioworld公司); 内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、p-eNOS抗体(Abcam公司); cleaved caspase-3抗体(万类生物公司); ECL检测试剂盒(凯基生物技术有限公司)。
1.3 仪器DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，Z233MK-2型低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，Synergy HT多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，超微量紫外可见分光光度计(中国百泰克生物技术有限公司)，TE2000-U倒置显微镜(日本尼康公司)，Gel Doc2000型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
1.4 方法 1.4.1 ARDS小鼠模型的制备将小鼠随机分为对照组(control组)、模型组(LPS组)、LBP+LPS组(LBP组)和LY294002+LBP+LPS组(LY294002组)，每组8只。小鼠称重后，腹腔注射4%水合氯醛(6 mg·kg-1)麻醉小鼠，LPS组、LBP组及LY294002组小鼠通过气管插管按5 mg·kg-1剂量滴注无菌LPS，建立ARDS模型。LBP组及LY294002组于LPS注射前2 h给予LBP(200 mg·kg-1)灌胃，LY294002组在LPS滴注前1 h颈静脉注射Akt抑制剂LY294002(40 mg·kg-1)，其余组给予等体积生理盐水。LPS滴注24 h后，4%水合氯醛麻醉，并放血处死小鼠。
1.4.2 肺组织HE染色及病理评分取左下肺组织，4%多聚甲醛固定72 h，切成5 μm石蜡切片，HE染色，光镜观察。肺损伤评分标准：肺泡及间质出血; 肺水肿; 肺泡腔或间质炎性细胞浸润或聚集; 肺泡壁增厚和/或透明膜形成。根据病变轻重评分：0分为无损伤; 1分为轻度病变; 2分为中度病变; 3分为重度病变; 4分为极重度病变。总评分为上述各项评分分数总和[6]。
1.4.3 肺湿干比(W/D)LPS滴注24 h后处死小鼠，取新鲜右肺组织，称重，即肺湿重(W)，再置于80℃恒温箱72 h后，称重，即干重(D)，计算肺W/D值。
1.4.4 小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)蛋白及炎症因子的检测LPS滴注24 h后，以1 mL无菌PBS缓冲液反复灌洗肺泡3次，确保回收率大于80%。4℃、12 000 r·min-1离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白含量; ELISA法检测TNF-α、IL-1β含量。
1.4.5 小鼠肺组织MDA及SOD的检测取右肺组织，肺组织重量按重量(g) :体积(mL)=1 :9加入0.9%生理盐水，冰水浴条件下，机械匀浆，制备10%的匀浆液，4℃、2 500~3 500 r·min-1离心10 min，取上清液。BCA法测样本蛋白浓度，根据MDA、SOD检测试剂盒说明书操作，分光光度计分别测定波长532 nm及550 nm处吸光度值。计算公式：肺组织MDA活性=(测定OD-对照OD)/(标准OD-空白OD)×标准品浓度÷待测样本蛋白浓度; 肺组织总SOD活性=(对照OD-测定OD)/对照OD÷50%×反应液总体积/取样量÷待测样本蛋白浓度。
1.4.6 生物素标记TUNEL检测小鼠肺组织凋亡取右上肺组织，卡诺氏液固定，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，按TUNEL试剂盒要求操作：石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS漂洗后，每个样本滴加100 μL 1×Proteinase K工作液，37℃湿盒反应20 min，PBS漂洗后，加50 μL连Streptavidin-HRP工作液，37℃湿盒反应60 min(注意避光)，PBS漂洗后，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。每组选2张切片，每张切片随机选取5个完整的高倍视野(×400)，计数200个细胞中的TUNEL染色阳性细胞数，计算凋亡指数(apoptotic index, AI)：AI/%=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.4.7 Western blot检测肺组织凋亡蛋白cleaved caspase-3及p-Akt、p-eNOS蛋白的表达将肺组织按每100 mg加入1 mL RIPA裂解液，冰上充分匀浆，裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，加1/4体积的5×loading buffer，混匀，100℃煮10 min。BCA法测定蛋白浓度，按30 μg蛋白/泳道上样，行聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移至PVDF膜，含5%脱脂奶粉或BSA的TBST封闭液室温摇床封闭1 h, 加入对应一抗，4℃冰箱过夜，加入HRP标记的二抗，37℃恒温箱孵育1 h，ECL显色，凝胶成像系统扫描成像，Quantity One软件进行灰度值分析。
1.4.8 统计学方法采用Graphpad Prism 5.0软件进行数据分析和作图。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差检验(One-way ANOVA)，各组均数间两两比较采用SNK-q检验法。
2 结果 2.1 LBP对LPS诱导的小鼠肺组织损伤的影响及LY294002的作用如Fig 1所示，对照组肺组织结构完整，肺泡间隔均一，无增宽，未见出血、水肿及炎性细胞浸润; LPS组肺组织损伤明显，肺泡间隔增厚明显，肺泡出血、伴大量水肿液及炎性细胞浸润; LBP组肺泡间隔轻度增宽，伴轻度出血、水肿及炎症细胞浸润; LY294002组与LPS组病理改变类似，但程度较轻。
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| Fig 1 Pathological changes in lung tissues (×400) A: Control group; B: LPS group; C: LBP group; D: LY294002 group; E: The lung injury scores in mice. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs LBP group. |
Tab 1结果显示，与对照组比较，LPS组、LBP组、LY294002组的W/D值均明显增高，差异均有统计学意义(P < 0.05);LBP干预后，W/D值较LPS组及LY294002组明显降低(P < 0.05)，LY294002组W/D值介于LBP组与LPS组之间。
| Group | W/D | Total protein/g·L-1 | TNF-α/ng·L-1 | IL-1β/ng·L-1 |
| Control | 3.99±0.50 | 1.35±0.46 | 26.02±6.73 | 24.33±5.72 |
| LPS | 8.32±0.59* | 9.97±1.03* | 181.90±12.75* | 156.70±8.91* |
| LBP | 5.98±0.52*# | 5.32±0.89*# | 102.40±10.23*# | 93.62±12.30*# |
| LY294002 | 7.19±0.29*△ | 7.71±0.44*△ | 141.90±7.93*△ | 131.70±6.37*△ |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs LPS; △P < 0.05 vs LBP | ||||
与对照组比较，LPS组、LBP组及LY294002组小鼠BALF中蛋白含量、TNF-α及IL-1β含量均明显增加，差异均有统计学意义(P < 0.05);LBP干预后，BALF中蛋白含量、TNF-α及IL-1β含量明显降低(P < 0.05);LY294002拮抗后，各项指标均明显增加(P < 0.05)。见Tab 1。
2.4 LBP对LPS诱导的小鼠肺组织MDA、总SOD的影响及LY294002的作用Tab 2结果显示，与对照组比较，LPS组、LBP组及LY294002组小鼠肺组织MDA含量明显增加，SOD活性明显下降(P < 0.05);LBP干预后，小鼠肺组织MDA含量明显降低，SOD活性明显增高(P < 0.05);LY294002拮抗后，MDA含量明显增高，SOD活性明显降低(P < 0.05)。
| Group | MDA/μmol·g-1 | SOD/kU·g-1 |
| Control | 1.21±0.13 | 86.03±3.48 |
| LPS | 2.16±0.12* | 51.57±6.68* |
| LBP | 1.62±0.06*# | 74.06±3.81*# |
| LY294002 | 1.91±0.07*△ | 64.21±2.49*△ |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs LPS; △P < 0.05 vs LBP | ||
如Fig 2所示，对照组中观察到极少数的TUNEL阳性细胞，而LPS组、LBP组及LY274002组小鼠肺组织中TUNEL阳性细胞明显增加，AI明显升高(P < 0.05);LBP干预后，小鼠肺组织中TUNEL阳性细胞及AI明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 2 Representative images of TUNEL staining of lung tissues(×400) A: Control group; B: LPS group; C: LBP group; D: LY294002 group; E: Quantitative analysis of the number of apoptosis index. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs LBP group. |
Fig 3的Western blot结果显示，与对照组比较，LPS组、LBP组及LY294002组小鼠肺组织cleaved caspase-3蛋白水平又明显增高(P < 0.05)，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明显降低(P < 0.05);LBP干预后，cleaved caspase-3水平明显降低，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明显增高(P < 0.05);LY294002拮抗后，p-Akt、p-eNOS蛋白水平明显降低(P < 0.05)。
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| Fig 3 Expression of cleaved caspase-3, p-Akt, p-eNOS in lung tissues of mice by Western blot (A) and relative protein expression(B) (x±s, n=8) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs LBP group |
ARDS是指由各种肺内外致病因素所导致的急性弥漫性肺损伤，进而发展的急性呼吸衰竭，主要病理特征为广泛的肺部炎症、肺血管内皮细胞损伤及肺微血管通透性增高导致的渗透性肺水肿[3]。因此，有效抑制肺部炎症反应，同时减轻肺微血管内皮屏障功能损伤，是降低ARDS患者病死率的有效治疗手段。
研究证实，LBP可通过抑制肝细胞TNF-α、IL-1及MDA含量，缓解四氯化碳诱导的急性肝损伤[7]，且可有效逆转由N-甲基-D天门冬氨酸诱导损伤的大鼠视网膜组织中eNOS表达下调[8]。研究还发现，LBP可作为一种新型抗氧化剂，激活PI3K/Akt/Nrf2信号通路，减轻高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗[9]。
本实验通过气管插管滴注LPS建立内源性小鼠ARDS模型，结果显示，LBP能有效抑制LPS诱导的小鼠急性肺损伤病理改变，并减轻肺水肿及BALF蛋白含量，说明LBP可以减轻ARDS时肺损伤，并改善肺微血管通透性。炎症细胞在ARDS的发生、发展中发挥重要作用，活化的内皮细胞炎症反应可诱导中性粒细胞激活、氧自由基形成、炎症介质释放等，导致肺微血管屏障功能损伤，肺微血管通透性增加，最终加重肺损伤[10]。本实验中，LBP能明显降低BALF中TNF-α及IL-1β含量，提示LBP能通过抑制炎症反应，对LPS诱导的ARDS发挥保护作用。研究表明，LPS等损伤性因素引起的肺损伤，引起氧自由基释放，可产生大量脂质过氧化物，进一步破坏细胞膜的结构和功能，导致肺毛细血管通透性增加，加重肺水肿的发生[11]。本实验中，LBP干预能明显降低肺组织MDA的水平，并增加SOD活性，提示LBP可抑制氧化应激反应，改善抗氧化能力，缓解急性肺损伤。
研究表明，肺微血管内皮细胞凋亡将导致肺微血管完整性受损，进而导致肺微血管通透性增高，加重肺损伤，其中cleaved caspase-3的出现，标志着细胞死亡已进入不可逆阶段[12-13]。本实验发现，LBP可明显降低肺内皮细胞的凋亡，以及凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达，提示LBP可抑制凋亡反应，改善肺内皮屏障功能障碍，减轻肺损伤。
Akt相关信号通路在细胞生存、增殖、分化、迁移等细胞功能中发挥重要的调节作用，是机体应对各种有害刺激的一种重要补偿机制[14-15]，其中，eNOS是Akt重要的下游靶点，在调节血管生长及内皮功能中发挥重要作用[2]。本课题组前期实验亦证实，Akt/eNOS信号通路参与网膜素介导的内皮屏障保护效应。在本实验中，LBP干预可明显提高ARDS小鼠肺组织Akt及eNOS蛋白的磷酸化水平，而Akt抑制剂LY294002能明显下调小鼠肺组织Akt及eNOS蛋白磷酸化水平，并阻断LBP的保护效应。提示LBP对ARDS小鼠肺损伤的保护作用，部分机制可能是通过调控Akt/eNOS信号通路。
综上所述，LBP可通过介导抗炎、抗氧化应激及抗凋亡作用，缓解ARDS肺微血管内皮屏障损伤，其机制可能与Akt/eNOS信号通路的激活有关。同时，由于ARDS发病机制错综复杂，LBP对ARDS的保护作用是否涉及其他信号通路，仍需进一步探讨。
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