2. 南方医科大学中心实验室，广东 广州 510515
2. Central Lab, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
钩藤具有清热平肝、息风止痉的功效，是治疗头痛眩晕、惊痫抽搐、妊娠子痫等病证的常用中药[1]。钩藤主要含生物碱、黄酮、三萜类等，其中钩藤碱含量约占总碱的34.5%~51.0%，为其主要有效成分，具有降血压、镇静、抗血小板聚集和抗血栓形成的作用[2]。本团队初期研究发现，钩藤碱具有抑制甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)引起的条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)的作用。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺合成的限速酶，它是控制运动和奖励相关行为的重要物质[3-4]。本文旨在探索钩藤碱对METH诱导的小鼠CPP的作用，应用蛋白免疫印迹和免疫组化法检测TH的表达，进一步阐明钩藤碱对METH依赖小鼠CPP的分子作用机制。
1 材料 1.1 药品与试剂盐酸甲基苯丙胺，购自国家麻醉品实验室，批号：1212-9802；钩藤碱，购自日本MATSUURA YKUGYO公司；盐酸氯胺酮注射液(规格：2 mL:0.1 g)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产；三卡因甲磺酸盐(MS222)，购自Sigma公司; 抗TH抗体(AB152)，购自Millipore公司。
1.2 仪器Noldus EthoVision XT 8.5软件(荷兰Noldus公司)；ChemiImager 550凝胶成像仪(美国Alpha Innotech公司)。
1.3 实验动物SPF级昆明种小鼠，体质量18~22 g，♀♂各半，由南方医科大学动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。
2 方法 2.1 CPP箱的制作CPP箱由两个长15 cm，宽15 cm，高15 cm的箱体组成，其中一箱体涂成黑色，另一箱体涂成白色；两箱体之间由一透明活动挡板分隔开，当透明挡板抽开时，小鼠可在两箱体间自由活动[5]。
2.2 小鼠基线测定实验前，将小鼠放于抽出挡板的CPP箱中，适应性喂养3 d后，进行小鼠位置偏爱测试。测试前将挡板抽出，小鼠放置于两箱体中间，记录小鼠在15 min内在黑白箱中的活动时间(以头部为准)。结果表明，自然状态下，＞90%的小鼠偏爱黑箱，因此，将黑箱选为偏爱箱，白箱选为伴药箱。小鼠筛选以在黑箱中的活动时间＞8 min为合格。
2.3 CPP模型的复制与给药取基线测定合格的小鼠50只，随机分成5组，分别为：空白对照组、模型组、钩藤碱低剂量组(40 mg·kg-1)、钩藤碱高剂量组(80 mg·kg-1)、氯胺酮组(15 mg·kg-1)。d 1, 记录小鼠15 min内在CPP箱中的活动。d 2~5，模型组和给药组每天上午8 :00皮下注射METH 4 mg·kg-1(对照组注射同体积生理盐水)，之后放入伴药箱中训练1 h；钩藤碱组从d 3开始，在注射METH前30 min，灌胃相应剂量的钩藤碱；氯胺酮组从d 3开始，在注射METH之前15 min，腹腔注射氯胺酮(15 mg·kg-1)；各组下午4 :00给予生理盐水(0.15 mL，sc)后，放入黑箱中训练1 h，连续4 d。d 6即末次给药24 h后，记录各组小鼠在CPP箱中15 min内的活动。
2.4 免疫组化法检测小鼠海马区TH的表达行为学测定完成后，处死小鼠，取脑组织，于4%多聚甲醛中固定24 h。脑组织进行常规脱水、包埋、切片，厚度约5 μm, 用防脱载玻片捞起，进行常规脱蜡和水化。按常规免疫组化法进行TH免疫组化染色，一抗为TH(1 :100)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 :200)，阴性对照则用PBS液代替一抗。结果判定阳性表达为胞膜和(或)胞质内呈棕黄色颗粒染色，若无棕黄色颗粒则为阴性。
2.5 Western blot检测TH的表达行为学测定结束后，将小鼠处死，取出小鼠的脑组织，加入RIPA裂解液和PMSF(50 :1)，进行超声匀浆提取组织蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，参考之前的文献进行Western blot实验。一抗为TH(1 :100)，以β-actin为内标；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 :1 000)。用ChemiImager 550凝胶成像仪采集图像，并用Image-Pro Plus 6.0软件分析每个条带的积分光密度(IOD)值。
2.6 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有数据以x±s表示，采用单因素方差分析，利用SNK检验法进行组间比较。
3 结果 3.1 小鼠训练前后在伴药箱的活动时间变化用Noldus EthoVision XT8.5软件，分析训练前后小鼠在伴药箱中的停留时间和运动轨迹，比较训练前后各组小鼠在伴药箱中活动时间的差值(小鼠训练后在伴药箱中的活动时间-小鼠训练前在伴药箱中的活动时间)。由Tab 1可见，与空白组相比，注射METH 4 mg·kg-1后，模型组小鼠在伴药箱中停留时间明显增加(P < 0.01)；与模型组相比，钩藤碱低、高剂量组小鼠在伴药箱中的停留时间明显减少(P < 0.01)。各组小鼠造模前后在CPP箱的运动路线图见Fig 1。
| Group | Does/ mg·kg-1 |
Mice activity time in non-preferred compartment before and after administration/s |
| Control | - | 8.80±12.30 |
| Model | 4 | 417.60±112.78** |
| Rhynchophylline | 40 | 415.10±158.81 |
| 80 | 57.60±17.16## | |
| Ketamine | 15 | 43.50±16.71## |
| **P < 0.01 vs control group; ## < 0.01 vs model group | ||
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| Fig 1 Road maps of mice in CPP compartment A: Control group before modeling; B: Control group after modeling; C: Methamphetamine model group before modeling; D: Methamphetamine model group after modeling; E: Rhynchophylline low-dose group before modeling; F: Rhynchophylline low-dose group after modeling; G: Rhynchophylline high-dose group before modeling; H: Rhynchophylline high-dose group after modeling; I: Ketamine group before modeling; J: Ketamine group after modeling. |
采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测定阳性细胞的IOD值，取其平均值作为该组各项指标的相对含量。如Fig 2所示，与对照组相比，经过CPP训练后，模型组小鼠海马区中TH阳性细胞数明显增加(P < 0.01)；与模型组相比，给予钩藤碱干预后，小鼠海马区TH阳性细胞数明显下降(P < 0.01)。
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| Fig 2 Micrographs of TH positive cells in hippocampus of mice (x±s, n=10) 1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group. |
如Fig 3所示，小鼠脑内的TH表达IOD值存在统计学差异。与对照组相比，模型组小鼠脑内的TH表达增加(P < 0.01)；与模型组相比，钩藤碱低、高剂量组小鼠脑内的TH表达明显减少(P < 0.01)。
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| Fig 3 Expression of TH of mice by western blot(x±s, n=3) 1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group. |
METH为白色透明不规则晶体，俗称“冰毒”，1919年由日本科学家首次合成，其特点为见效快、药效持续时间长。国家禁毒办公布的《2017年中国禁毒报告》显示，2016年缴获各类毒品82.1吨，其中冰毒晶体17.4吨，位于榜首。METH有很强的中枢兴奋作用，极易成瘾，且复吸率高。
CPP实验是一种常用的药物奖赏效应以及药物渴求研究的动物模型，是评估药物依赖精神依赖性最方便、最常用、最经典的实验。人为地将药物与动物先天的非偏爱侧相联系，通过对比动物在非偏爱侧停留时间的长短，判断药物精神依赖性的强弱[6]。本实验结果表明，与对照组比较，给予METH 4 mg·kg-1后，模型组小鼠在伴药箱中的时间明显增加，说明注射METH 4 mg·kg-1可以诱导小鼠产生CPP效应。与模型组相比，钩藤碱低、高剂量组(40、80 mg·kg-1)小鼠在伴药箱中的逗留时间明显减少，表明低、高剂量钩藤碱对METH依赖小鼠CPP具有一定的抑制作用。
药物成瘾的机制十分复杂，与脑内多种蛋白质表达和结构功能改变有关。TH在儿茶酚胺生物合成过程中至关重要，是其中最重要的关键酶，同时也是多巴胺能神经元的标记酶，与药物依赖奖赏通路密切相关。研究表明，与正常组相比，给予苯丙胺50 mg·kg-1, 可使斑马鱼端脑区TH mRNA的表达明显上调[7]; 斑马鱼腹腔注射40 mg·kg-1 METH 3次后，其脑内TH蛋白的表达明显增加[8]。腹腔注射METH(2.5、10 mg·kg-1)7 d后，小鼠纹状体中TH蛋白的表达，以及黑质TH基因表达水平和TH阳性神经元数量减少[9]。将TH-GFP转基因斑马鱼(头部荧光)浸泡在浓度为0.6 mg·L-1 METH中，转基因斑马鱼头部荧光明显增强[10]。本实验结果表明，与对照组比较，给予METH 4 mg·kg-1后，METH依赖小鼠脑内TH阳性细胞数及TH蛋白的表达明显增加；给予钩藤碱干预后，小鼠脑内TH阳性细胞数和TH蛋白表达明显减少，表明TH与钩藤碱抑制METH引起的CPP效应有关，是动物行为学改变的神经生物学机制之一。
钩藤碱是中药钩藤的主要活性成分，本团队前期研究发现，钩藤碱能抑制苯丙胺类物质诱导大鼠产生CPP，抑制苯丙胺所致大鼠脑内氨基酸类神经递质含量变化和大鼠伏隔核、杏仁核中NR2B蛋白表达的变化[11-12]。钩藤碱可抑制METH引起的大鼠伏隔核内GluR2/3亚基蛋白表达上调，以及下丘脑内GluR2/3亚基蛋白表达下调[13]。钩藤碱(60 mg·kg-1)可抑制METH依赖大鼠海马CA1区和纹状体中p-CREB、c-Fos阳性细胞数明显增加的趋势，使p-CREB及c-Fos阳性细胞数恢复正常[14]。
本研究表明，钩藤碱具有抑制METH依赖小鼠CPP的作用，这种作用可能与降低小鼠脑内TH蛋白的表达有关。由于药物成瘾的发生与发展极其复杂，关于钩藤碱调控TH的机制仍需进一步深入研究。
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