2. 中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031
2. Institute Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China
1957年，Charlotte Friend在成年小鼠脾脏内发现了一种新型逆转录病毒，该病毒可使小鼠的脾脏发生肿大，使小鼠产生红白细胞血症，最终导致小鼠死亡，该病毒被命名为MuLV (murine leukemia virus)/Friend病毒[1]。MuLV/Friend由MuLV和脾脏病灶病毒(spleen focus-forming virus, SFFV)两种病毒构成。其中，MuLV不具备致病性，但能够进行复制，起到辅助感染的作用；SFFV具备致病性，但不具备复制能力，因此，需将SFFV包装入MuLV，形成MuLV/Friend才具备感染能力[2-3]。MuLV/Friend能感染造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)，其编码的gp55蛋白能够与红细胞生成素受体(erythropoietin receptor, EPOR)结合。小鼠感染MuLV/Friend后，可促使体内的红系祖细胞在没有红细胞生成素(erythropoietin, EPO)的情况下，仍分化为红细胞，并定位在脾脏中，导致脾脏肿大，最终小鼠因脾破裂死亡[4-6]。
MuLV/Friend感染小鼠模型的建立，在研究逆转录病毒致病机制、抗病毒策略评价，以及肿瘤的发生中具有重要的意义。MuLV/Friend感染急性阶段，血液中病毒载量快速上升，引发机体免疫反应以抑制病毒复制，随后，感染进入慢性阶段，在此过程中，病毒整合到宿主基因组中[7]。由于MuLV/Friend与人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)病毒复制特性及急性临床症状相似，MuLV/Friend感染的小鼠艾滋病模型被用来研究机体抗逆转录病毒免疫机制，以及用于体内评价抗HIV-1药物的安全性和有效性[8]，且因为MuLV/Friend在慢性感染阶段会诱发肿瘤，这一模型也被广泛地应用到探讨肿瘤发生、发展机制及评价治疗策略等方面[4, 9-10]。
目前，对于检测病毒的复制主要采用计算病毒感染导致的脾肿大指数(splenic index, SI)的方法[11]，该方法不能实时、精确地定量病毒复制及在其它组织中的分布。本研究中，我们建立了一种基于实时荧光定量(qRT)-PCR[12]的病毒复制检测方法，可用于实时定量小鼠各组织内病毒载量，为利用MuLV/Friend小鼠感染模型研究抗逆转录病毒策略或宿主免疫等，提供一种特异、快速、灵敏的监测病毒复制的手段。
1 材料与方法 1.1 实验动物MuLV/Friend病毒感染6~8周龄♀ BALB/c小鼠，购自上海灵畅生物科技有限公司，动物合格证号为：SCXK(沪)2013-0018。实验获得中国科学院上海巴斯德研究所动物伦理批件(IPS动伦审第2013014号)。
1.2 试剂与仪器戊巴比妥钠(上海隆盛公司)；TRIzol试剂(Life Technologies公司)；三氯甲烷、异丙醇(上海沪试公司)；RNA逆转录试剂盒(TOYOBO公司)；DNA聚合酶(Vazyme公司)；T4 DNA连接酶(NEB公司)；PMD-19T载体(TaKaRa公司)；快速质粒小提试剂盒(TIANGEN公司)；qRT-PCR TaqMan试剂盒(康为世纪公司)。Prism7900实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。
1.3 qRT-PCR定量标准品的构建MuLV/Friend病毒株由广州中医药大学符林春教授惠赠。TRIzol试剂提取病毒基因组RNA，利用RNA逆转录试剂盒逆转录为cDNA；扩增病毒gag区域，连入PMD-19T载体，构建标准品质粒；利用Nanodrop测量质粒浓度，并根据标准品质粒分子量，计算质粒拷贝数。扩增gag使用上游引物序列为5′-CTCTTTCTCCGAGGACCCAG-3′，下游引物序列为5′-GTCATTGGGCAGCTGAGTTG-3′，合成特异性荧光探针，探针序列为5-Carboxyfluorescein(5-FAM)-ACAGCTTTGATCGAGTCCGTTCTCCT-Carboxytetramethylrhodamine(TAMRA-3)。gag扩增条件为：95℃，10 min，预变性；95℃，15 s，变性；60℃，1 min，退火/延伸，40个循环。
1.4 BALB/c小鼠感染、组织RNA的抽取及病毒载量检测6~8周龄BALB/c小鼠饲养于SPF级动物房。BALB/c小鼠腹腔接种MuLV/Friend; 感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d后，戊巴比妥钠安乐死，小鼠解剖后获取各组织。将组织充分研磨，50 mg组织加入1 mL TRIzol试剂，充分混匀，室温静置10 min，待组织充分裂解；加入200 μL三氯甲烷，摇晃15 s，室温静置10 min，液体分层；4℃、12 000×g离心10 min；将上清转入新的EP管中，加入500 μL异丙醇，上下颠倒6~8次，室温静置10 min；4℃、12 000×g离心10 min，弃上清，加1 mL 4℃预冷的75%乙醇；4℃、12 000×g离心5 min，弃上清，待沉淀干燥后，加入适量DEPC水溶解抽提的RNA，并利用Nanodrop测量RNA浓度。利用上述条件，qRT-PCR扩增病毒gag区域，参考标准曲线，定量各组织内病毒载量。
2 结果 2.1 qRT-PCR定量标准品的构建利用DNA聚合酶试剂盒扩增病毒gag区域，连入PMD-19T载体，构建标准品质粒；Nanodrop测量质粒浓度，根据标准品质粒分子量，计算出质粒拷贝数, 标准品质粒进行10倍比稀释，共7个浓度梯度(Tab 1)。在扩增反应中，qRT-PCR仪检测gag区域探针荧光信号，并获得各浓度标准品的Ct值(Tab 1)，该Ct值与各浓度标准品拷贝数的Log值可构建标准曲线(Fig 1A)，能够对MuLV/Friend病毒进行定量。核酸电泳验证目的扩增条带的分子量(Fig 1B)；以水为模板作阴性对照，扩增所得Ct值为34.3，高于稀释10-10倍的标准品Ct值，因此，利用该建立的qRT-PCR方法，最低可以监测到10-9倍稀释的标准品，其对应的MuLV/Friend拷贝数为1.54×105 copies·L-1。该检测方法具有较高的灵敏度。
| Dilution | Copies/mL | Log copies | Ct value |
| 1/10 000 | 15 400 000 | 7.2 | 14.1 |
| 1/100 000 | 1 540 000 | 6.2 | 17.5 |
| 1/1 000 000 | 154 000 | 5.2 | 21.9 |
| 1/10 000 000 | 15 400 | 4.2 | 24.3 |
| 1/100 000 000 | 1 540 | 3.2 | 28.4 |
| 1/1 000 000 000 | 154 | 2.2 | 31.8 |
| 1/10 000 000 000 | 15.4 | 1.2 | 36.2 |
| Water | 37.4 | 1.6 | 34.3 |
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| Fig 1 Establishment of standard curve for real-time quantitative reverse transcription PCR assay A:A standard curve was established using multiple diluted gag standard substances; B:Amplified gag DNA bands were detected by agarose electrophoresis. M:Marker; Lane1-7:The serial dilution of standard substances from 10-4 to 10-10; 8:The negative control, using water as the template for RT-PCR. |
为分析急性感染阶段MuLV/Friend在各组织器官内的分布情况，BALB/c小鼠腹腔接种1×109拷贝数的病毒，感染14 d后，戊巴比妥钠安乐死，解剖后取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠道、胸腺、脑、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、payers’淋巴结、血清和白细胞，利用建立的qRT-PCR法，检测各组织器官中gag区域的Ct值，并将所得Ct值引入标准曲线公式，计算可得各组织器官中的病毒载量拷贝数。感染14 d，发现明显的脾肿大(Fig 2A)，并发现心、肝、脾、肺、肾、肠道、胸腺、脑、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、payers’淋巴结、血清和白细胞中，均有不同程度的病毒复制，而血液和脾脏中病毒载量高于其他组织(Fig 2B)。结果表明，感染后14 d，病毒已建立了系统感染，且病毒在血液和脾脏中复制较高。
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| Fig 2 Viral distribution in tissues(n=8) BALB/c mice were infected via i.p. with MuLV/Friend for 14 d, and the splenomegaly was observed (A). a:mock (PBS) infection; b:virus infection. Viral loads in multiple tissues were quantified (B). |
为进一步监测MuLV/Friend急性感染期病毒复制动力学，我们分析了急性阶段脾脏和血液中病毒载量的动态变化。BALB/c小鼠腹腔接种1×109拷贝数的病毒，分别感染2、4、5、7、10、12、16、20、28 d，每组3只小鼠，戊巴比妥钠安乐死，解剖后取小鼠的血液和脾脏，利用qRT-PCR检测法检测血液和脾脏中的gag区域的Ct值，并将所得Ct值引入标准曲线公式，计算后得血液和脾脏中MuLV/Friend的拷贝数(Fig 3)。结果表明，在感染10 d时，病毒载量达到了顶峰，随即下降。
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| Fig 3 Dynamic kinetics of virus replicationin blood and spleen(x±s, n=3) Viral loads in blood and spleen were quantified at the indicated time of post-infection. |
MuLV/Friend是一种逆转录病毒，能引起小鼠红白细胞血症，其发病过程与HIV-1引起的人类免疫缺陷综合症相似，常用于感染小鼠建立小鼠艾滋病模型，研究宿主抗病毒反应和评价抗病毒策略[9]。感染初期，MuLV/Friend能促使红系祖细胞在不依赖红细胞生长素情况下在脾脏中大量分化，形成红细胞，导致脾脏肿大[5-6, 13]。感染后期，会使原癌基因和抑癌基因发生突变，诱发肿瘤[11]。传统方法主要通过计算脾肿大指数检测病毒复制，但敏感度不够高，结果不够精确，需要建立一种灵敏度更高，且操作简便的方法检测MuLV/Friend的感染复制。因此，我们构建了基于qRT-PCR的方法，可用于实时监测MuLV/Friend的复制。本研究通过构建MuLV/Friend病毒标准品，并设计病毒gag区域特异性探针，利用qRT-PCR，最低可监测到1.54×105 copies·L-1的MuLV/Friend病毒，相较于过去计算病毒导致脾肿大指数的方法，更为直接和精确，操作也相对简便，为定量分析MuLV/Friend复制提供了有效手段。利用该方法检测感染后d 14各组织器官的病毒载量，发现脾脏和血液中的病毒载量高于其他组织，说明脾脏和血液是MuLV/Friend主要复制位点，提示在分析MuLV/Friend急性感染动力学中，应更多关注脾脏和血液中的病毒复制状况。监测MuLV/Friend急性感染期脾脏和血液中的病毒复制动态曲线，发现病毒载量在感染d 10最高，随后下降, 这与之前文献报道相一致[7, 14]，也说明了该方法的可靠性。
借助MuLV/Friend感染小鼠模型，可研究逆转录病毒感染初期宿主免疫反应。利用该模型已分析了CD4+、CD8+ T细胞及B淋巴细胞在感染中的作用，如CD4+和CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ可以抑制病毒复制；CD4+辅助型T细胞和滤泡辅助型T细胞可以增加细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)反应，促使B细胞产生中和性抗体[7-8, 15]。利用MuLV/Friend感染小鼠模型分析逆转录病毒急性感染阶段的宿主免疫反应，与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)感染非人灵长类模型以及病人取材相比，更具有可控性、方便性，因此，这一模型在逆转录病毒感染研究中具有重要的应用意义。
( 致谢: 感谢广州中医药大学符林春教授惠赠MuLV/Friend病毒株。)
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