2. 安徽卫生健康职业学院，安徽 池州 247099;
3. 安徽医科大学附属第一医院内分泌科，安徽 合肥 230022;
4. 安徽医科大学药学院临床药学专业2014级，安徽 合肥 230032;
5. 安徽中医药大学附属第一医院内分泌科，安徽 合肥 230031
2. Anhui Hygiene and Health Professional School, Chizhou Anhui 247099, China;
3. Dept of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China;
4. Grade 2014, Dept of Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
5. Dept of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230031, China
慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，其中肥胖是CKD进展的渐进性独立风险因子，但影响的具体途径尚不确切[1]。最近临床和动物实验表明，肥胖引起的CKD肾中由脂类的异位沉积、脂类代谢失调和氧化应激组成的应激信号网络共同参与CKD的发生、发展[2]。
丹蛭降糖胶囊(Danzhi Jiangtang Capsule，DJC)是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，由太子参、生地黄、菟丝子、牡丹皮、水蛭等药组成，具有益气、养阴、活血之功效，对2型糖尿病及其并发症有确切的疗效[3]。DJC改善糖尿病大鼠肾功能的机制可能是通过抗氧化，从而抑制JAK2/STAT3炎症信号通路的活化，降低肾脏局部炎症因子的表达[4]。DJC也可通过下调肥胖大鼠骨骼肌细胞CD36的表达，减轻骨骼肌脂质沉积，来改善骨骼肌胰岛素抵抗[4]。但目前关于DJC是否可作为调血脂药物，改善脂代谢紊乱和肾损伤及其机制的研究尚未见报道，因此，本文探讨DJC保护高脂血症大鼠肾损伤的作用机制，为该药用于临床治疗肥胖引起的CKD提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物清洁级SD大鼠，♂，8周龄，体质量180~200 g，购自安徽医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(皖)2006-001，适应性饲养1周。
1.1.2 药物与试剂DJC购自安徽中医药大学附属第一医院药房；RNAiso Reagent、逆转录试剂盒、Premix TaqTM购自大连宝生物工程有限公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司；兔抗磷酸化腺苷酸活化的蛋白激酶α(phospho-AMP-activated protein kinase α，p-AMPKα)和AMPKα单克隆抗体购自美国CST公司；兔抗过氧化物酶体增殖剂活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)、PPARγ多克隆抗体购自美国Affinity公司；兔抗CD36多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗β-actin、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL高灵敏度化学发光试剂盒购自美国ThermoFisher公司；甘油三酯(triglyceride，TG)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，TSOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。所有引物均采用Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.1.3 仪器Olympus AU640全自动生化分析仪；日本Nikon 80i荧光正置显微镜；英国Teche PCR仪；北京六一仪器厂电泳仪、电转仪；Gel Documentation system曝光系统和Chemi Scope series凝胶成像系统均购自Clinx科学仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 动物分组与处理将SD大鼠随机分为正常对照组(CON，n=10)，高脂饮食组(HFD，n=40)。CON组喂基础饲料，HFD组喂自制的高脂饮食(由55%基础饲料、12%猪油、5%蔗糖、8%奶粉、5%花生、10%鸡蛋、3%芝麻油、2%食盐组成)。12周后，取体质量明显增加的大鼠30只，随机分为HFD组、高脂饮食+低剂量DJC治疗组(HFD+DJCL)和高脂饮食+高剂量DJC治疗组(HFD+DJCH)，每组10只。HFD组继续给予高脂饮食8周，HFD+DJCL和HFD+DJCH组在给予高脂饮食的同时，分别给予DJC 500、1 000 mg·kg-1·d-1干预8周，CON和HFD组分别灌胃等体积的蒸馏水。所有操作均遵守安徽医科大学实验动物伦理委员会要求。
1.2.2 血清代谢指标分析所有大鼠禁食12 h后称重，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血分离血清(3 000 r·min-1，15 min)，分析血清TG、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)、肌酐(serum creatinine，Scr)水平。
1.2.3 肾匀浆TG和氧化应激指标测定称取肾组织，冰水浴条件下，用匀浆器制备成10%的组织匀浆，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，取上清。MDA、TSOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px、TNOS测定均按照相应的试剂盒说明书进行。称取组织后，按100 g·L-1加入无水乙醇，匀浆器匀浆，4℃放置1 h，4℃、4 000 r·min-1离心15 min，取上清液进行TG的测定。
1.2.4 肾脏的HE、油红O和PAS染色将大鼠肾脏用4%的多聚甲醛溶液固定72 h，石蜡包埋，3 μm切片后行HE染色，并拍照。将-80℃冻存的肾脏取出制备冰冻切片，4%的多聚甲醛溶液固定30 min，1，2-丙二醇室温孵育2 min，油红O工作液染色60 min，苏木精染液复染后，甘油明胶封片。PAS染色按照试剂盒说明书进行，将切片用95%的乙醇固定10 min，10 g·L-1过碘酸液作用20 min，Schiff染液中染色60 min，苏木精染液复染10 min后拍照。
1.2.5 肾脏免疫组化分析石蜡包埋肾组织以4 μm连续切片，SABC法进行CD36的免疫组化分析，DAB显色，脱水、透明和封片，光镜下观察并拍照，每张切片随机选取10个视野，棕黄色颗粒区为阳性信号，并用生物图像软件计算各组免疫阳性细胞的平均光密度值(integral optical density, IOD)。
1.2.6 RT-PCRRNAiso Plus提取各组大鼠肾组织的RNA，按照RT试剂盒说明书操作得到cDNA后，常规PCR反应扩增基因。PCR产物经过琼脂糖电泳后，凝胶成像系统拍照并分析灰度值。RNA的相对表达水平以目的基因灰度值与内参GAPDH的比值表示。检测的目的基因及引物序列见Tab 1。
| Gene | Primers(5′-3′) |
| SREBP1c | F: ATGGACGAGCTGGCCTTCGGTGAGGCGGCT |
| R: CCAGAGAGGAACCCAGGGCCGCAG | |
| FASN | F:GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT |
| R:TGGGTAATCCATAGAGCCCAG | |
| GAPDH | F: GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG |
| R: ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA |
RIPA裂解液提取各组肾组织的蛋白质后，BCA法测定其浓度，10% SDS-PAGE电泳分离，转膜，分别以β-actin(1：400)、phospho-AMPKα(1：1 000)、AMPK(1：1 000)、PPARα(1：800)、PPARγ(1：800)孵育过夜，二抗(1：10 000)孵育2 h，TBST漂洗，电化学发光系统显色成像，凝胶分析软件计算目标蛋白的相对表达含量，实验重复3次。
1.3 统计学分析计量数据以x±s表示，采用SPSS 16.0软件分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用最小显著差异法(LSD法)。
2 结果 2.1 DJC对高脂饮食大鼠体质量及血清脂代谢、肾功能的影响与CON组相比，HFD组大鼠血清TG、TC、BUN、UA、Scr浓度均升高，HDL-C浓度下降，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；与HFD组相比，HFD+DJCL、HFD+DJCH组的血清TG、TC、UA、Scr水平均降低，HDL-C水平上升，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，有一定的剂量效应。4组大鼠之间体质量的变化差异无统计学意义(Tab 2)。
| Group | Body weight/g | TG/mmol·L-1 | TC/mmol·L-1 | HDL-C/mmol·L-1 | BUN/mmol·L-1 | UA/mmol·L-1 | Scr/mmol·L-1 |
| CON | 409.38±132.81 | 0.39±0.14 | 1.00±0.36 | 1.09±0.21 | 6.17±0.86 | 66.25±4.57 | 31.75±7.45 |
| HFD | 450.25±29.63 | 0.77±0.12# | 1.44±0.28# | 0.54±0.08## | 7.48±0.57# | 118.33±56.65## | 53.00±2.64## |
| HFD+DJCL | 422.84±109.93 | 0.57±0.25** | 1.24±0.35* | 0.85±0.43** | 6.40±2.38 | 98.43±22.11* | 45.73±2.45* |
| HFD+DJCH | 435.75±29.15 | 0.48±0.28** | 1.04±0.27* | 1.11±0.25** | 6.12±1.79 | 75.65±6.13** | 36.12±2.36** |
| #P < 0.05，##P < 0.01 vs CON group; *P < 0.05，**P < 0.01 vs HFD group | |||||||
如Fig 1所示，与CON组相比，HFD组大鼠肾匀浆TG明显升高(P＜0.01)，而与HFD组相比，DJC 2个剂量组均可明显降低肾匀浆的TG含量(P＜0.05)。与CON组相比，HFD组肾匀浆CAT、TNOS、TSOD、CuZn-SOD水平明显降低，GSH-Px、MDA水平明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；DJC组肾匀浆CAT、TNOS、TSOD、Cu Zn-SOD水平上升，GSH-Px、MDA水平明显降低，以HFD+DJCH组最为明显，并有一定的剂量效应(P＜0.05，P＜0.01)。见Tab 3。
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| Fig 1 Effect of DJC on triglyceride levels in kidney ##P < 0.01 vs CON group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFD group |
| Group | CAT/kU·g-1 Pro | GSH-Px/kU·g-1 Pro | MDA/μmol·g-1 Pro | TNOS/kU·g-1 Pro | CuZn-SOD/kU·g-1 Pro | TSOD/kU·g-1 Pro |
| CON | 2.374±0.85 | 4.92±0.83 | 1.23±0.45 | 1.79±0.37 | 150.00±10.40 | 115.00±12.14 |
| HFD | 0.773±0.22# | 15.23±1.15# | 1.80±0.72# | 0.40±0.31# | 75.00±6.13# | 63.00±5.32# |
| HFD+DJCL | 1.264±0.91* | 12.80±0.94* | 1.24±0.54* | 1.27±1.05** | 105.00±18.10* | 89.00±8.34* |
| HFD+DJCH | 1.865±0.73** | 8.13±1.03* | 1.18±0.32* | 1.53±0.79** | 123.00±20.12** | 105.00±11.10* |
| #P < 0.05 vs CON group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFD group | ||||||
HE结果显示，与CON组对比，HFD组大鼠肾脏的肾小球体积明显增大，系膜细胞增殖，肾小囊腔变大；DJC治疗后肾脏的上述病变明显减轻，以HFD+DJCH组更为明显(Fig 2)。油红O结果显示，与CON组对比，HFD组大鼠的肾小球和肾小管脂质沉积明显增多；DJC治疗后肾小管的脂质沉积明显减轻，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。PAS染色结果显示，与CON组比较，HFD组大鼠的肾小球系膜基质中有大量糖原沉积，而DJC治疗组大鼠的肾小球系膜基质中的糖原含量减少，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，以HFD+DJCH组病变程度更轻，有一定的剂量效应(Fig 3)。
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| Fig 2 Effect of DJC on pathological changes in kidney induced by HFD(HE staining, ×400) A: Control diet group; B:HFD group; C:HFD and DJC 500 mg·kg-1·d-1 group; D:HFD and DJC 1 000 mg·kg-1·d-1 group. |
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| Fig 3 Effect of DJC on pathological changes in kidney induced by HFD(×400) A: PAS staining of kidney; B: Oil red-O staining of kidney; C: Quantification of PAS staining; D: Quantification of Oil red-O staining. ##P < 0.01 vs CON group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFD group. |
CD36主要分布在胞膜和胞质的核内体、内质网及线粒体[6]。与CON组对比，HFD组大鼠肾脏CD36的表达明显增多，差异有统计学意义(P＜0.01)；DJC治疗组肾脏CD36的表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，且随着剂量的增大，CD36的表达进一步降低(Fig 4)。
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| Fig 4 Effect of DJC on expression and distribution of FAT/CD36 in kidney by immunohistochemistry(×400) A:Control diet group; B: High-fat diet group; C: HFD and DJC 500 mg·kg-1·d-1 group; D: HFD and DJC 1 000 mg·kg-1·d-1 group; E: Quantification of immunohistochemistry. ##P < 0.01 vs CON group; **P < 0.01 vs HFD group. |
与CON组对比，HFD组肾脏组织中SREBP1c、FASN基因的mRNA水平表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.01)，HFD+DJC组的SREBP1c、FASN基因表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01), 见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of DJC on mRNA expression of SREBP1cand FASN in kidney by RT-PCR ##P < 0.01 vs CON group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFD group |
与CON组对比，HFD组肾脏组织中的p-AMPK、PPARα蛋白表达明显减少，PPARγ的表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)；与HFD组相比，HFD+DJC组肾脏组织p-AMPK、PPARα蛋白表达明显升高，PPARγ的蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，且有一定的剂量效应(Fig 6)。
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| Fig 6 Effect of DJC on expression of p-AMPK/AMPK, PPARα and PPARγ in kidney by Western blot #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CON group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFD group |
中心性肥胖和脂代谢紊乱、高尿酸血症可引起并加重肾脏损害。在本研究中，我们应用SD大鼠高脂血症模型评价了DJC的降脂活性，并探讨了其基于AMPK信号通路的降脂作用机制。HFD组大鼠表现为高脂血症和高尿酸、肌酐、尿素氮血症，肾脏内有明显的脂质沉积；DJC治疗后，血脂、尿酸、肌酐、尿素氮和肾内脂质沉积明显降低，提示其具有改善血脂、肾功能和肾内脂质异位沉积的作用，并有一定的剂量效应。
脂质在肾脏内沉积，可通过过氧化反应产生MDA和各种自由基，引起氧化应激。现代药理学研究表明，DJC组方中太子参、牡丹皮能升高SOD活性，降低MDA水平，减少氧化应激[7-8]；地黄被广泛地用于滋阴养肾，其中的活性成分梓醇能降低糖尿病大鼠的血浆TC、TG水平，升高HDL-C水平，同时通过升高胰腺中SOD、GSH-Px、CAT水平，减少MDA水平来减少氧化应激[9]。因此，推测复方制剂DJC可能也有减少氧化应激的作用。本研究证实了DJC能通过增加肾脏中CAT、TSOD的表达以及激活TNOS、降低MDA水平来发挥抗氧化作用，并有一定的剂量效应。Sun等[10]的研究也证实，在糖尿病肾病模型中，DJC有抗氧化作用，与本研究的结果一致。DJC中与抗氧化作用相关的单体成分还有待进一步的分离鉴定。
CD36是介导长链脂肪酸、氧化型脂质等的结合和摄取的多功能受体。肾脏CD36主要表达在肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞中，高脂血症、高血糖和CKD患者中CD36的表达明显上调，在小鼠中阻止CD36的表达可防止CKD的进展，提示其在肾损伤中的重要作用，成为CKD的潜在治疗靶标[11]。本研究结果表明，高脂饮食确实引起了CD36在肾组织中的表达升高，这与文献报道一致，而不同剂量的DJC治疗均可减少CD36的表达，且有一定的剂量效应，提示DJC治疗CKD的作用可能与其调节CD36的表达有关。
AMPK是一种重要的细胞能量调节器，与肥胖、高脂血症、糖尿病等多种由能量代谢异常引起的疾病相关[12]。有文献报道，AMPK的激活抑制了肝SREBP1c的功能，从而抑制了肝脏脂肪的生成[13]。我们的研究则表明DJC可能通过激活高脂血症大鼠肾组织中AMPK，增加下游脂肪分解基因PPARα的表达，减少下游PPARγ、SREBP1c、FASN基因的表达，来减少肾脏脂质的沉积和减轻体重，改善肾组织内的脂代谢紊乱。
综上所述，DJC能有效降低高脂血症大鼠的血脂、肾脏TG和缓解肾脏内的氧化应激水平，并能明显改善大鼠的肾功能。机制研究表明，DJC能通过激活AMPK，进而活化下游脂肪分解基因PPARα的表达，抑制CD36和脂肪生成基因PPARγ、SREBP1c、FASN的表达，并有一定的剂量效应，这为DJC在CKD的临床治疗应用上提供了新的证据支持。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学基础医学院药理学教研室、生物化学与分子生物学教研室和综合实验室完成，感谢实验室老师和同学们给予的帮助和指导！)
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