2. 成都市青白江区人民医院重症监护病房, 四川 成都 610300
2. ICU, Qing baijiang Hospital of Chengdu, Chengdu 610300, China
对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)为常见的解热镇痛药，过量服用该药物可产生严重肝毒性。APAP导致肝损伤的机制为过量APAP进入肝脏，经CYP450s介导产生毒性活性代谢产物N-乙酰-对苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinoneimine, NAPQI)，其不仅可耗竭肝脏内谷胱甘肽(glutathione, GSH)，还可与细胞内大分子物质发生共价结合，最终导致肝损伤(Fig 1)[1-2]。因此，CYP450s活性变化将直接影响APAP毒性活性代谢产物NAPQI的产生，继而影响肝毒性的发生。
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| Fig 1 Formation of reactive NAPQI from APAP and related mechanism for induced hepatotoxicity |
妊娠后，体内激素水平会随着妊娠周期有所波动，而该波动会影响肝脏CYP450s活性水平。研究显示，妊娠期间肝脏CYP2C9、2D6、2E1、3A的活性均会上调[3-4]，故孕期用药药物药代动力学参数的变化一直是研究的热点。早在1986年，Miners等[5]便报道了孕期APAP的口服清除率较非孕期高58%。随后Larrey等[6]也发现，给予妊娠17~18 d小鼠400 mg·kg-1 APAP后，24 h小鼠肝脏转氨酶水平升高。Neto等[7]于2004年报道了长期给予妊娠大鼠1 500 mg·kg-1 APAP(从妊娠d 1到妊娠结束)后，母体及胎儿的肝脏和肾脏均有明显损伤。Thiele等[8]发表的荟萃分析也表明，过量APAP对妊娠期母体和胎儿均存在较大风险。FDA颁布的妊娠用药指南中，将APAP纳入B级(B级：副作用在动物繁殖性研究中得到证实，而不曾在已妊娠3个月的孕妇中证实)。Franko、Thornton等[9-10]分别在2013和2012年报道了妊娠中期孕妇过量服用APAP导致肝移植的病例，APAP孕期安全性评价又重新引起关注[11]。目前并无直接证据表明妊娠中期和晚期肝脏对APAP的耐受性有差异，同时，肾脏作为APAP的主要排泄器官，单剂量APAP是否会引发孕期肾损伤也未知。鉴于APAP妊娠用药的生殖毒性，以及对子代行为学影响已研究较多，本研究将主要关注APAP 500 mg·kg-1(正常小鼠的最大可耐受剂量[8])对不同妊娠时期(未妊娠时期、妊娠中期、妊娠晚期)母鼠肝肾功能的影响，同时探究相关机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂APAP购于中国食品药品检定研究院, 纯度>99%；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、肌酐(creatinine，Cre)、尿素氮(urea nitrogen, BUN)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、GSH、丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 实验动物SPF级昆明小鼠120只，体质量(20 ± 2) g，购自重庆中药研究院，生产许可证号：SCXK(渝)2017-0003。
1.1.3 仪器API 4000 Qtrap(2台岛津LC-20AD泵，ESI接口离子源，Analyst Software 1.5.1色谱工作站)；BS-220全自动生化分析仪(深圳迈瑞)；超高速离心机(美国Thermo Scientific公司)。
1.2 孕鼠的制备将♀鼠和♂鼠按照2 :1合笼饲养，并于合笼后的每日清晨、中午及晚上检查♀小鼠是否出现阴栓(作为判断受孕的直接证据)；同时做阴道涂片观察小鼠的动情周期。阴栓是小鼠在交配后形成的白色浆状物质，堵塞于阴道腔内，是动物已交配的标志，本研究将阴栓出现当天作为妊娠“0 d”。
1.3 实验分组实验分为未妊娠组、妊娠中期组(受孕后7~15 d，本实验采用受孕后10 d小鼠)、妊娠晚期组(受孕后15~21 d，本实验采用受孕后18 d小鼠)。灌胃给予上述各组小鼠APAP 500 mg·kg-1，并于给药后0(不同妊娠期各自空白对照组)、6、24、48 h后取材。给药结束后，动物禁食不禁水，并于各时间点摘眼球采血，进行血清生化指标检测。同时取部分肝、肾组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，以备后续病理切片。其余的肝组织-80℃冰箱保存待用。
1.4 血清生化指标的检测ALT、AST、ALP、Cre、BUN等血液生化指标采用全自动生化分析仪检测。
1.5 肝、肾组织氧化应激指标的检测肝、肾组织中SOD、GSH、MDA含量按照南京建成试剂盒说明书测定。
1.6 肝、肾组织HE病理切片制备将固定液中肝、肾组织石蜡包埋, 切片, 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色后, 光学显微镜下观察病理学变化。
1.7 小鼠肝微粒体的制备每份肝、肾取0.1 g，即每组各0.5 g，加入3倍体积冰冷的PBS匀浆，3 500 r·min-1离心30 s(离心2次)。弃去沉淀和上层白色物质。将上清液装入特制离心管中，PBS配平至误差在0.01 g以内，超高速离心(105 000×g，60 min)，所得沉淀用pH 7.4的Tris缓冲液重悬浮，得到肝微粒体溶液，BCA试剂盒法测定其蛋白含量。
1.8 “Cocktail”探针法检测CYP450s活性[12]向50 μL探针药物(其中右美沙芬2.5 μmol·L-1、非那西丁10 μmol·L-1、甲苯磺丁脲100 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1、咪达唑仑5 μmol·L-1)中加入50 μL的小鼠肝微粒体(0.5 g·L-1)，接着加入100 μL NADPH(1 mmol·L-1)启动反应，37℃孵育15 min。反应结束后，加入2倍体积冰甲醇(含有75 μg·L-1内标卡马西平)终止反应。10 000 r·min-1离心10 min，LC-MS/MS“Cocktail”探针法分析上清液[12]。
1.9 NAPQI-GSH结合物测定[13]100 μL 10%组织匀浆+400 μL甲醇沉淀，13 000 r·min-1离心5 min，取上清LC-MS/MS分析。流动相：A：水(0.1%甲酸)，B：乙腈(0.1%甲酸)；色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18，3.5 μm，2.1 mm×50 mm Part No. USHP004814；柱温：30℃；流速：0.5 mL·min-1；进样量：10 μL；梯度洗脱(A:0 min→4 min, 98%→2%)，ESI+，MRM模式监测离子对457.1/328.1。
1.10 统计学分析数据以x±s表示，采用统计软件SPSS 19.0进行数据统计分析。组间两两比较采用t检验，多组比较选用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果 2.1 APAP对不同妊娠期小鼠肝脏组织病理学的影响如Fig 2所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1 APAP后，未妊娠组小鼠在0、6、24、48 h的肝细胞排列正常，门管区未见炎细胞浸润。妊娠中期小鼠肝小叶在6 h时出现炎细胞浸润；24 h时肝小叶结构模糊, 小叶内肝细胞水肿且胞质淡染；48 h时少量肝细胞排列混乱。妊娠晚期小鼠仅在6 h时观察到肝小叶内有少量炎细胞浸润，其余时间点的小叶内肝细胞基本正常。结果提示，在给予同等剂量的APAP后，妊娠中期小鼠出现了轻微的肝细胞损伤，但在48 h时损伤开始恢复。而未妊娠和妊娠晚期小鼠均未出现明显的肝组织损伤病理学变化。
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| Fig 2 Liver histological evaluation of APAP-treated pregnant mice →: The infiltration of lymphocytes. |
如Fig 3A~3C所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1 APAP后，未妊娠组和妊娠晚期组小鼠在0~48 h内的血清ALT、AST、ALP水平均无明显波动，而妊娠中期组这3个转氨酶水平在6 h时明显升高(P < 0.01)，随后在24~48 h内又恢复到正常水平。值得注意的是，妊娠中期组和妊娠晚期组小鼠血清ALP水平的基础值(0 h)均明显低于未妊娠组(P < 0.01)。
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| Fig 3 Effects of APAP on the serum activity of ALT (A), AST (B), ALP (C) and on liver MDA (D), SOD (E), GSH (F) contents in pregnant mice(±s, n=10) ##P < 0.01 vs 0 h of mid-pregnancy group; **P <0.01 vs un-pregnant group |
如Fig 3D~3F所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1 APAP后，小鼠肝组织MDA水平变化趋势在3组中基本一致：在24 h时明显升高(P < 0.01)，在48 h时又恢复到正常水平。SOD水平变化：未妊娠组在0~48 h内有升高趋势；妊娠中期组则是先升高后降低(0~6 h升高，12~48 h降低)；而妊娠晚期组则无明显波动。值得注意的是，妊娠中期和晚期组小鼠血清SOD水平的基础值(0 h)均明显高于未妊娠组(P < 0.01)。GSH水平变化：未妊娠组小鼠在0~6 h出现短暂降低后，又于12~48 h内恢复到正常水平；妊娠中期组小鼠则是在0~48 h内持续降低；而妊娠晚期组小鼠在0~48 h内无明显波动。值得注意的是，妊娠中期组小鼠血清GSH水平的基础值(0 h)均明显高于未妊娠组(P < 0.01)。
2.4 APAP对不同妊娠期小鼠肾脏组织病理学的影响如Fig 4所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1 APAP后，各组小鼠在0~48 h内，肾小球、肾小囊形态结构正常，肾小囊未见沉积物，肾小管未见冠心，上皮细胞未见肿胀变性。上述结果表明，500 mg·kg-1 APAP对妊娠各时期小鼠肾脏组织病理无明显影响。
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| Fig 4 Kindy histological evaluation of APAP-treated pregnant mice |
如Fig 5所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1 APAP后，未妊娠组、妊娠中期组和晚期组小鼠的血清Cre和BUN水平在0~48 h内无明显波动。MDA和SOD水平变化：仅妊娠晚期组在6 h时出现了短暂升高，而后在12~48 h又降低恢复到正常水平；其余组在0~48 h内无明显变化。GSH水平变化：妊娠中期组在0~48 h内有持续降低现象，而其他组未见明显波动。
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| Fig 5 Effects of APAP on the activity of BUN and Cre in serum, and on the activity of SOD, the levels of GSH and MDA in kidney tissue of pregnant mice (x±s, n=10) ##P < 0.01 vs 0 h of each group; **P < 0.01 vs un-pregnant group |
如Fig 6A所示，小鼠在妊娠中期(妊娠后10 d)的肝脏CYP1A2、2D6、3A4、2E1酶活性水平明显高于未妊娠小鼠(P < 0.01)，而上述代谢酶活性水平在妊娠晚期(妊娠后18 d)，恢复到未妊娠时水平。
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| Fig 6 The CYP450s activity(A) and the contents of NAPQI-GSH(B) in liver of different pregnant mice treated with APAP (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs un-pregnant mice |
APAP的毒性物质基础为其活性代谢产物NAPQI，其稳定性较差，不能被直接检测，但其可被GSH捕获，生成NAPQI-GSH复合物，故研究中常用NAPQI-GSH水平来反映NAPQI生成量。本研究也对给药后，各组肝脏中的NAPQI-GSH生成量进行了检测。如Fig 6B所示，给予APAP后，各组NAPQI-GSH水平在6 h时均有升高，但仅妊娠中期组存在明显差异(P < 0.05)，而在随后的48 h内，NAPQI-GSH在肝脏中水平急剧降低。
3 讨论妊娠是非常复杂的生理过程，是妇女的一段特殊时期，该时期用药应尤为谨慎。肝脏作为人体最大的代谢器官，含有丰富的药物代谢酶系统，妊娠期激素水平变化影响着肝脏各种代谢或抗氧化酶的水平变化。临床和实验研究表明，妊娠期间CYP450s活性的变化可影响美托洛尔、咖啡因、罗红霉素等药物药代动力学的变化[3]。本研究也证实，妊娠中期肝脏CYP450s主要代谢酶的活性水平上调，这与之前的研究结果相一致[3, 14]。Ning等[15]研究表明，肝细胞核因子4α激活介导了妊娠期小鼠Cyp2d40的表达上调，而其他CYP450s表达上调是否也与该转录因子相关，还有待进一步研究。本研究所观察到的妊娠晚期小鼠肝脏CYP450s活性又趋于正常，这可能跟妊娠期间激素的周期性变化有关，而究竟是哪种激素还有待进一步研究。此外，本研究还发现，妊娠中期和晚期组小鼠血清SOD水平，中期组小鼠的GSH水平均明显高于未妊娠组。该结果提示，在妊娠时期机体自身抗氧化能力增强，可应对突发的自由基水平升高，由于SOD等抗氧化酶表达主要由Nrf2信号通路调控，故妊娠期间的激素水平是否会影响Nrf2信号通路的下游蛋白调控，也有待于进一步研究。
综上所述，本研究表明，500 mg·kg-1 APAP可致妊娠中期小鼠产生急性轻微肝损伤，这可能是妊娠中期小鼠肝CYP450s活性升高，以及SOD活性、GSH水平上调共同调节的结果。本研究提示妊娠中期由于CYP450s活性上调，发生经CYP450s介导产生肝毒性的风险上升，临床用药应更关注该时期的用药方案。
( 致谢: 本实验在西南大学药学院中药药理学实验室完成，感谢给予实验指导、帮助的老师和同学。)
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