2. 河北省人民医院药学部，河北 石家庄 050051
2. Department of Pharmacy, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051
甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种叶酸拮抗剂，通过抑制二氢叶酸还原酶，阻止癌细胞分裂，用于治疗急性白血病[1]、乳腺癌、绒毛上皮癌等癌症。低剂量甲氨蝶呤用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病等自身免疫性疾病[2]。由于缺乏特异的毒性生物标志物，甲氨蝶呤副作用的发生往往是不可预知的，应根据患者疾病的需求选择适当剂量的氨甲喋呤并监测血药浓度。
左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)在临床上主要用于治疗各种癫痫，其机制可能是通过选择性地抑制癫痫样放电，以及与突触囊泡白蛋白2A结合，对突触前突触囊泡释放神经递质产生影响[3]，具体机制目前尚不清楚。左乙拉西坦临床用于4岁以上儿童癫痫患者部分性发作的加用治疗。左乙拉西坦副作用较小，目前临床上进行了左乙拉西坦治疗自闭症[4]、头痛[5]等疾病研究。加拿大卫生部提示，左乙拉西坦和甲氨蝶呤相互作用具有潜在风险。这两种药物合用可能会导致血液中甲氨蝶呤浓度升高，引起可能是致死性(包括突发急性肾衰竭)的严重副作用。文献报道，甲氨蝶呤和左乙拉西坦都是p-gp的底物[6-7]。由于在甲氨蝶呤和左乙拉西坦在临床上存在合用的可能性，而这两药合用后可能会发生相互作用，因此开展此研究，以期为临床合理用药提供依据。
1 材料 1.1 药品与试剂甲氨蝶呤(索莱宝公司，纯度：99%)；左乙拉西坦(J & K Scientific Ltd，纯度：99%)；氨基蝶呤(上海源叶生物有限公司，纯度：99%)；甲醇、乙腈、三蒸水等。
1.2 仪器Shimadzu LC-30AD型超高效液相色谱系统(日本岛津公司)；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四级杆串联质谱仪(美国AB公司)；Hettich Zentrifuge 1602型高速低温离心机(德国Hettich公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AB204-S型标准型的分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；Milli-Q纯水仪(默克化工技术有限公司)等。
1.3 实验动物健康♂ SD大鼠，体质量(250±20) g，由河北医科大学中实验动物中心提供，生产合格证号:1707095，使用许可证号：SCXK(冀)2013-10003。
2 方法 2.1 色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY®UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱温：40℃；自动进样器：4℃；流动相：乙腈(B)、含0.1%甲酸水(A)，梯度洗脱(0 min，5% B; 3.5 min，95% B；4 min，95% B；4.2 min，5% B；4.5 min，stop)；时间：4.5 min；流速：0.2 mL·min-1；进样量：2 μL。
2.2 质谱条件离子化源：电喷雾离子源(ESI)，正离检测；气帘气压力为30 kPa；碰撞气压力是8 kPa；喷雾电压是5 500 V；去溶剂温度为600℃；雾化气压力为60 kPa；辅助气压力是60 kPa；入口电压是10 V；碰撞室出口电压为14 V。MTX、LEV和氨基蝶呤(内标)的质谱参数见Tab 1。
| Determinand | Precusorion /m/z | Production /m/z | Residing time/ms | DP /eV | CE /eV |
| MTX | 455.4 | 308.3 | 100 | 45 | 20 |
| LEV | 171.0 | 126.0 | 100 | 48 | 20 |
| Internal standard | 441.2 | 294.1 | 100 | 100 | 17 |
分别精密称取MTX、LEV适量，放到10 mL棕色的容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成MTX、LEV浓度分别是2.2 mmol·L-1和5.9 mmol·L-1的贮备液，于4℃冰箱储存。用移液枪分别精密吸取MTX、LEV标准品贮备液适量，用50%甲醇水溶液逐级稀释，配制成MTX浓度为11、4.4、2.2、1.1、0.22、0.11、0.022、0.011 μmol·L-1的工作液和LEV浓度为58.8、29.4、11.8、5.88、2.94、0.588、0.294、0.0588 μmol·L-1工作液，备用。精密称取氨基蝶呤(内标)适量置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度线均匀，配制成浓度为0.227 mmol·L-1的内标贮备液，置于4℃冰箱保存。精密吸取氨基蝶呤500 μL，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2.27 μmol·L-1的内标，4℃冷藏，备用。
2.3.2 标准曲线和质控样品配制用移液枪量取5 μL上述配好的工作液，加入45 μL空白大鼠血浆配制MTX和LEV的血浆标准曲线，使得终浓度分别为1.1、2.2、11、22、110、220、440、1 100 nmol·L-1；5.88、29.4、58.8、294、588、1 180、2 940、5 880 nmol·L-1。精密称取MTX和LEV各10.0 mg，按照上述方法配制低、中、高3个质控制(QC)样品，MTX、LEV浓度分别为2.2、110、880 nmol·L-1；11.8、588、4 700 nmol·L-1。
2.4 给药方案、样品采集与处理大鼠随机分为3组：1 mg·kg-1 MTX组、180 mg·kg-1 LEV组、合用组，每组5只。在0、0.16、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h眼底静脉丛取血，离心取血浆用于检测；将大鼠饲养于代谢笼，并按分组灌胃给药，于8、24、48 h收集尿液用于检测；按上述分组给药后在1、2、4 h取大鼠肝、肾标本进行HE染色。取血浆、稀释尿液样品50 μL，加入10 μL内标和150 μL甲醇沉淀剂，涡旋2 min，离心(12 000×g，10 min)，取上清液100 μL用于UPLC/MS/MS的测定。血浆和尿液于-20℃冰箱保存待测。
2.5 方法学验证 2.5.1 专属性按照“2.3”项下要求，用大鼠的空白血浆，配成1.1 nmol·L-1的MTX和5.88 nmol·L-1 LEV血浆样品，与空白血浆经处理后一起分析，观察空白血浆中的成分是否对待测物和内标存在干扰。
2.5.2 线性、最低定量限按照“2.3”项下要求配制标准曲线，以待测物浓度(x)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，并计算标准曲线的线性回归系数(r2>0.99)。最低定量(LLOQ)为标曲的最低点。
2.5.3 精密度、准确度按照“2.3”项下要求配的3个QC浓度的样品，每一浓度6个样本，1 d内同批次处理，连续检测3 d并进行分析，根据当日的标准曲线计算QC样品浓度，评价分析方法的准确度与精密度结果RSD和RE应在± 15%之内。
2.5.4 提取回收率、基质效应按照“2.3”项下要求配制3个QC浓度的血浆样品，每个浓度6个样本，并按照“2.4”项进行处理后进行分析。样本为A。分别取5只大鼠的空白血浆50 mL，加入150 mL甲醇，涡漩1 min后离心(12 000 ×g，10 min)，取上清液45 mL，加入5 mL工作液(相当于甲氨蝶呤2.2、110、880 nmol·L-1；左乙拉西坦11.8、588、4 700 nmol·L-1)，按照“2.4”项处理后，LC-MS/MS测定。样本为B。按照“2.3”项下要求，配的3个QC浓度的工作液，每个浓度6个工作液，并直接进样分析。样本为C。计算公式：提取回收率=A/B；基质效应=B/C。
2.5.5 稳定性稳定性考察是指甲氨蝶呤和左乙拉西坦在血浆样品室温放置4 h、经历3次冷冻、解冻循环和4℃冷藏8 h的稳定性。按照“2.3”项下要求，配制低、中、高浓度的QC血浆样品，每个浓度在每个稳定条件平行6个样本进行分析。储存的样品与新配制样品相比较来证明样品稳定性。用空白大鼠血浆稀释工作液，每一个浓度平行6个样本，考察稀释稳定。样本浓度均在配制浓度的±15%范围，则样品稳定。
2.5.6 生物样品的适用性按照“2.3”项下要求，分别制备3个浓度的QC，每浓度平行6份的稀释尿液样品进行分析。样品浓度的RSD在±15%以内，则该分析方法适用于稀释尿液样品。
2.6 数据处理与统计分析药代动力学参数采用非房室模型通过WinNolin 7.0计算，数据结果用x±s表示，使用Graphpad Prism5软件进行作图与统计学分析，未配对资料的两均数间通过双侧检验作显著性分析。
3 结果 3.1 方法学 3.1.1 专属性血浆样品中，甲氨蝶呤、左乙拉西坦、氨基蝶呤保留时间分别为3.02 min、3.09 min和2.95 min，空白血浆中的内源性物质不干扰测定，方法专属性高(Fig 1)。
|
| Fig 1 Representive MRM chromatograms of IS, MTX and LEV A, D, G:Representative chromatograms blank plasma; B, E, H: Representative chromatograms of blank homogenate spiked with IS, LEV and MTX; C, F, I: Representative chromatograms of plasma sample from pharmacokinetic study after coadministration of LEV and MTX. IS: Aminopurine; MTX: Methotrexatein; LEV: Levetiracetam. |
左乙拉西坦：y=0.061 2x+0.2429 (r2=0.991 9)；线性范围为5.88~5 880 nmol·L-1，最低定量限为5.88 nmol·L-1；甲氨蝶呤：y=0.026 6x+0.462 5 (r2=0.9936)；线性范围为1.1~1 100 nmol·L-1，最低定量限1.1 nmol·L-1。
3.1.3 精密度和准确度甲氨蝶呤和左乙拉西坦的质控样品在日内精密度、日间精密度、准确度都符合生物样本要求(Tab 2)，表明该分析方法的重现性比较好，可用于检测左乙拉西坦和甲氨蝶呤的浓度。
| Analytes | Concentration /nmol·L-1 | Intra-day | Intra-day | |||||
| Founded concentration /nmol·L-1 | RSD /% | RE /% | Founded concentration /nmol·L-1 | RSD /% | RE /% | |||
| Levetiracetam | 11.8 | 11.81±0.646 | 5.6 | 0.5 | 11.5±0.646 | 5.6 | -2.5 | |
| 588 | 611±10.6 | 1.8 | 4 | 593±21.0 | 3.6 | 1 | ||
| 4 700 | 4 606±147.5 | 3.2 | -2 | 4 576±138.7 | 3 | -2.6 | ||
| Methotrexatein | 2.2 | 2.33±0.22 | 9.1 | 6 | 1.05±0.07 | 7 | -5 | |
| 110 | 108±4.24 | 3.9 | -1 | 50.70±2.33 | 4.6 | 1.4 | ||
| 880 | 877±50 | 5.7 | -0.3 | 870±39.3 | 4.5 | -1.1 | ||
甲氨蝶呤和左乙拉西坦在3个浓度水平上的提取回收率、基质效应都符合药典规定(Tab 3)。
| Determinand | Concentration/nmol·L-1 | Extraction recovery/% | Matrix effect/% | |||||
| Levetiracetam | 11.8 | 98±3 | 92±3 | |||||
| 588 | 92±5 | 93±6 | ||||||
| 4 700 | 90±4 | 94±7 | ||||||
| Methotrexatein | 2.2 | 96±6 | 90±5 | |||||
| 110 | 97±6 | 88±4 | ||||||
| 880 | 95±7 | 95±2 | ||||||
| aPlace 4h at room temperature(25℃)；b4℃ storage for 8 h；c-20℃ refrigeration cycle three times | ||||||||
甲氨蝶呤和左乙拉西坦血浆样品室温放置4 h、经历3次冷冻、解冻循环和4℃冷藏8 h后，稳定性良好，见Tab 4；血浆样品稀释后，甲氨蝶呤和左乙拉西坦的精确度和准确度都满足要求(Tab 5)，表明样品可被稀释。
| Storage condition | Added concentration /nmol·L-1 | Levetiracetam | Added concentration /nmol·L-1 | Methotrexatein | ||||
| Founded concentration /nmol·L-1 | RSD /% | RE /% | Founded concentration /nmol·L-1 | RSD /% | RE /% | |||
| 25℃a | 11.8 | 10.9±0.11 | 10.3 | -7.5 | 2.2 | 2.39±0.24 | 10.1 | 9 |
| 588 | 569.9±47 | 8.2 | -3 | 110 | 101.2±8.8 | 8.7 | -8 | |
| 4 700 | 4 488±276 | 6.2 | -4.5 | 880 | 849.3±63.8 | 7.5 | -3.5 | |
| 4℃b | 11.8 | 12.3±0.09 | 4.3 | 4.5 | 2.2 | 2.09±0.154 | 7.4 | 5 |
| 588 | 95±7 | 7.3 | 5 | 110 | 105.6±7.48 | 7.1 | 4 | |
| 4 700 | 815±43 | 5.3 | 1.9 | 880 | 825±68.2 | 8.2 | -6.3 | |
| -20℃c | 11.8 | 1.85±0.53 | 4.9 | -7.5 | 2.2 | 1.87±0.154 | 8.2 | -1.5 |
| 588 | 564±41.1 | 7.3 | -4 | 110 | 114.4±11 | 9.6 | 4 | |
| 4 700 | 4 800±159 | 3.3 | 2.1 | 880 | 849.4±48.4 | 5.7 | 3.5 | |
| Added concentration /mmol·L-1 | Dilution factor | Levetiracetam | Added concentration /μmol·L-1 | Dilution factor | Methotrexatein | ||||
| Founded concentration /mmol·L-1 | RSD /% | RE /% | Founded concentration /μmol·L-1 | RSD /% | RE /% | ||||
| 0.0529 | 10 | 0.051 1±0.002 9 | 5.7 | -3.3 | 2.2 | 10 | 2.1±0.04 | 2.1 | 5.0 |
| 0.235 | 100 | 0.221±0.016 | 7.4 | -6.0 | 8.8 | 100 | 8.47±0.55 | 6.5 | 3.9 |
| 5.29 | 1 000 | 5.02±0.19 | 3.7 | -5.1 | 110 | 1 000 | 106.7±5.9 | 5.6 | -3.0 |
为了分析该方法在稀释尿液样品中的适用性，我们分析了3个浓度的稀释尿液样品，其RSD和RE值满足要求(Tab 6)。
| Analyte | Added concentration /nmol·L-1 | Urine | ||
| Founded concentration/nmol·L-1 | RSD/% | RE/% | ||
| Levetiracetam | 11.8 | 11.9±0.881 | 7.4 | 2.0 |
| 588 | 603.9±14.7 | 2.4 | 2.8 | |
| 4 700 | 4 623.7±12.3 | 2.7 | -1.6 | |
| Methotrexatein | 2.2 | 2.17±0.132 | 6.1 | -2.0 |
| 110 | 115.7±5.72 | 4.9 | 5.2 | |
| 880 | 840.6±50.6 | 6.0 | -4.5 | |
为了探究MTX和LEV在大鼠体内的相互作用，我们进行了大鼠体内的药代动力学试验。MTX和LEV在大鼠体内的药代动力学参数见Tab 7，药时曲线见Fig 2。两药合用后，MTX的Cmax、AUC0-t、Tmax值升高，T1/2、Cl、MRT值下降，各参数差异有统计学意义；LEV的Tmax、T1/2、Cl有一定的上升趋势，AUC0-t有一定的下降趋势，各参数差异无统计学意义。结果表明LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收。
| Pharmacokinetic parameters of MTX | Pharmacokinetic parameters of LEV | ||||
| MTX | MTX+LEV | LEV | LEV+MTX | ||
| T1/2/min | 405.07±34.82 | 349.60±10.39* | T1/2/min | 287.60±27.57 | 318.40 ±37.84 |
| Tmax/min | 50.00±17.32 | 70.00±17.32* | Tmax/min | 60.00±30.00 | 90.00±30.00 |
| Cmax/μg·L-1 | 28.60±10.45 | 52.33±12.07* | Cmax/mg·L-1 | 256.30±22.90 | 225.00±24.98 |
| AUCM0-t/min·ng-1mL-1 | 8230±2274 | 15003±4359* | AUC0-t/min·μg-1mL-1 | 109 454±11 527 | 105 182±12 725 |
| Cl/mL·min-1kg-1 | 161.80±47.60 | 90.43±22.76* | Cl/mL·min-1kg-1 | 0.46±0.04 | 0.48±0.06 |
| MRT/min | 376.80±77.68 | 312.80±45.72* | MRT/min | 332.20±24.27 | 387.00± 27.85 |
| *P＜0.05 vs MTX group | |||||
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| Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of MTX and LEV in rats A: Mean plasma concentration-time curves of MTX after oral administration MTX and MEX plus LEV; B: Mean plasma concentration-time curves of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV. |
为了探究MTX血药浓度升高对肾脏排泄的影响，我们通过代谢笼验证了MTX和LEV单用及合用后大鼠的肾脏排泄水平。在8、24、48及48 h总量4个水平上，与口服单用MTX和LEV组相比，MTX肾脏排泄量在合用组明显增多，而LEV的肾脏排泄量在合用组减少，差异均有统计学意义(Fig 3)。结果表明，LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收，使其血药浓度升高、肾排泄增加。
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| Fig 3 Renal excretion of MEX and LEV in rats A: Renal excretion of MEX after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h. *P < 0.05 vs MTX group; B: Renal excretion of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs LEV group. |
为了探究MTX血药浓度及尿排泄的增加对肝肾急性毒性的影响，选取给药后1、2、4 h 3个时间点，取老鼠肝、肾组织，经福尔马林溶液固定24 h后，经石蜡切片进行HE染色后。肝脏病理切片结果显示，与对照组相比，MTX组、LEV组肝脏均无明显的病理变化，MTX和LEV合用组肝损伤也不明显，仅在4 h组在肝门静脉附近肝细胞有少量的空泡样变性(红色箭头所示部位，Fig 4)。肾脏病理切片结果显示，与对照组相比，LEV组大鼠肾脏无病理学改变，MTX组大鼠肾脏在肾小球附近部分肾小管可见轻微损伤，表现为颗粒空泡样变性、管腔轻度扩张(红色箭头所示部位)，MTX和LEV合用组肾小管损伤明显增加，表现为肾小管大量的颗粒空泡样变性、部分刷毛缘脱落、部分管腔可见细胞碎片(红色箭头、红色方框所示部位，Fig 5)。结果表明，合用MTX和LEV后大鼠肝肾毒性都明显增加，且肾脏毒性的增加远高于肝毒性。
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| Fig 4 Rats liver pathological slices(HE×200) Rat liver was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased liver damage significantly. |
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| Fig 5 Rats kidney pathological slices(HE×400) Rat kidney was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased kidney damage significantly. |
由于MTX具有抗炎和免疫抑制双重作用[8]，因此在临床应用比较广泛，但其毒副作用也比较明显。2017年3月23日，国家药品不良反应监测中心发布的药物警戒快讯中提到，加拿大卫生部提示LEV和MTX合用可能会导致血液中MTX浓度升高，引起可能是致死性(包括突发急性肾衰竭)的严重副作用[8]。我们的实验证明，LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收，使其血药浓度升高，肾排泄增加，造成明显的肝肾损伤，且对肾脏毒性的影响要明显大于肝脏毒性。有文献报道[9]，LEV可以延长MTX的排泄。本实验结果表明，口服合用LEV与MTX后，MTX的排泄明显增加，而LEV的排泄明显减少。MTX的排泄明显增加可能是因为MTX血药浓度增加的原因，但也不排除LEV与MTX在肾脏发生相互作用的可能。考虑到合用LEV与MTX后，LEV在血药浓度变化无统计学意义的情况下肾脏排泄明显减少，MTX与LEV以肾脏为靶点发生相互作用的可能性是很大的，需要进一步实验来验证两药在肾脏相互作用的机制。本实验结果提示，临床上联合使用LEV与MTX时需要进行剂量调整。
( 致谢: 感谢河北省临床医学研究中心/河北省代谢病重点实验室提供大鼠实验的实验室；感谢河北省人民医院病理科康林老师对病理切片结果的指导。)
| [1] | 李园, 王迎, 林冬, 等. 大剂量甲氨蝶呤治疗成人急性淋巴细胞白血病的药物代谢研究[J]. 癌症进展, 2015, 13(1): 100-4. Li Y, Wang Y, Lin D, et al. A study on pharmacokinetics of high dose methotrexate (HD-MTX) in adults with acute lymphoblastic leukemia[J]. Cancer Prog, 2015, 13(1): 100-4. |
| [2] | 黄晶, 舒晓明, 王贵, 等. 甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的作用机制[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2016, 10(21): 3276-80. Huang J, Shu X M, Wang G, et al. Mechanism of methotrexate in treating rheumatoid arthritis[J]. Chin J Clin (Elect), 2016, 10(21): 3276-80. doi:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2016.21.028 |
| [3] | Wang M, Jiang L, Tang X. Levetiracetam is associated with decrease in subclinical epileptiform discharges and improved cognitive functions in pediatric patients with autism spectrum disorder[J]. Neuropsych Dis Treat, 2017, 13: 2321-6. doi:10.2147/NDT |
| [4] | Wasserman S, Iyengar R, Chaplin W F, et al. Levetiracetam versus placebo in childhood and adolescent autism: a double-blind placebo-controlled study[J]. Int Clin Psychopharmacol, 2006, 12(6): 363-7. |
| [5] | Verma A, Srivastava D, Kumar A, et al. Levetiracetam in migraine prophylaxis: a randomized placebo-controlled study in a rural medical institute in northern India[J]. Clin Neuropharmacol, 2013, 36(6): 193-7. doi:10.1097/WNF.0000000000000005 |
| [6] | Zhu Y, Meng Q, Wang C, et al. Methotrexate-bestatin interaction: involvement of P-glycoprotein and organic anion transporters in rats[J]. Int J Pharm, 2014, 465(1-2): 368-77. doi:10.1016/j.ijpharm.2014.02.020 |
| [7] | Luna-Tortos C, Fedrowitz M, Loscher W. Several major antiepileptic drugs are substrates for human P-glycoprotein[J]. Neuropharmacology, 2008, 5(8): 1364-75. |
| [8] | 原琴琴, 周玉敏, 顾兵, 等. 低剂量甲氨蝶呤的抗炎作用机制及其在脊髓损伤中应用[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(3): 312-6. Yuan Q Q, Zhou Y M, Gu B, et al. Anti inflammatory mechanism of low-dose methotrexate and its application in spinal cord injury[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(3): 312-6. |
| [9] | Reeves D, DiDominick S, Finn S, et al. Methotrexate elimination when coadministered with levetiracetam[J]. Ann Pharmacother, 2016, 50(12): 1016-22. doi:10.1177/1060028016661572 |