2. 南昌市第三医院麻醉科，江西 南昌 330006;
3. 南昌市第三医院护理部，江西 南昌 330006
2. Department of Anesthesiology, The Third Hospital of Nanchang, Nanchang 330006, China;
3. Department of Nursing, The Third Hospital of Nanchang, Nanchang 330006, China
葛根是豆科多年生落叶藤本植物，其干燥根入药为葛根，是常用中药，始载于《神农本草经》。葛根素(puerarin，Pue)为其主要有效成分，属异黄酮类，分子式为C21H20O9，化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4′, 7-二羟基异黄酮[1]。研究表明，葛根素具有很多药理作用[2]，包括良好的抗心律失常、抗心肌缺血作用、抗氧化作用、拮抗Ca2+超载、抑制细胞凋亡、降血糖和血脂、减轻炎症反应、改善心肌收缩、促进微循环等作用。
临床上，当心肌出现缺血缺氧时会造成一定的损伤，解决的办法就是尽快恢复血供，然而供血后非但不能减轻损伤，反而加重细胞功能代谢障碍和结构损伤的现象，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。近年来，研究发现[3]，线粒体通透性转换孔道(mitochondria permeability transition pore, mPTP)与心肌I/R损伤密切相关。mPTP的开放，将引起I/R损伤从可逆向不可逆转变。因此，要实现有效的心肌保护作用，可通过降低mPTP的开放程度或增加mPTP的关闭来实现。mPTP由多种蛋白构成，是一种非选择性、高导电性的复合孔道，位于线粒体的内外膜之间，由位于外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)、基质的亲环素D(cyclophilin D, CyP-D)和内膜的腺苷酸转运酶(adenylate transporter, ANT)等组成[4]。其中VDAC担任通道开关的角色，调节mPTP的开放和关闭，控制着离子和代谢物的转运，进而影响一些生理及病理过程[5]。VDAC有3个亚型，其中VDAC1在哺乳动物线粒体膜上分布最广、生理作用最关键。Wang等[6]研究发现，在肾小管上皮细胞，葛根素可有效抑制铅介导的mPTP开放及细胞凋亡。本实验室前期研究表明[7, 9]，葛根素可通过上调PKCε蛋白，对抗心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤，且终浓度为320 μmol·L-1时细胞存活率最高。因此，在此基础上，我们推测葛根素可能通过影响mPTP开放，从而对抗I/R损伤，发挥心肌保护作用。本研究拟在心肌细胞建立A/R损伤模型，研究葛根素的心肌保护作用及其与VDAC1/mPTP线粒体通路的关系，阐明葛根素对抗心肌I/R损伤的分子生物学机制，为其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株大鼠H9c2心肌细胞株，购自中国科学院细胞库。
1.1.2 药品与试剂葛根素购自中国药品生物制品检定所；特级胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自WISENT公司；高糖(dulbecco’s modified of eagle’s medium, DMEM)培养基购自Solarbio公司；TransZol购自北京全式金生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；Real-time PCR试剂盒购自德国QIAGEN生物公司；Anti-VDAC1(ab15895)和Anti-beita Actin(ab6276)购自Abcam公司；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L), ZB-2301)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L), ZB-2305)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Lipofectamine 2000TM脂质体购自Invitrogen公司；线粒体提取试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，购自江苏凯基生物科技公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其余化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器FormaTM 310直热式CO2培养箱、全波长酶标仪、三气培养箱(美国Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超净化工作台(苏州净化设备)；倒置显微镜(日本Olympus)；Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)；5804-R低温高速离心机(德国Eppendorf)；DYY-Ⅱ型稳压电源(北京六一仪器厂)。
1.2 H9c2心肌细胞的培养H9c2心肌细胞接种于无菌的细胞培养板，含10% FBS的高糖培养基提供营养，置于含5% CO2，37℃恒温、湿度饱和的清洁无菌孵箱中培养。
1.3 H9c2心肌细胞A/R模型的建立心肌细胞生长至接近融合状态时，弃培养基，换用模拟缺氧缺糖溶液(pH=6.8，NaH2PO4 0.9 mmol·L-1、KCl 10.0 mmol·L-1、Hepes 20.0 mmol·L-1、NaHCO3 6.0 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 mmol·L-1、乳酸钠40.0 mmol·L-1、CaCl2 1.0 mmol·L-1、NaCl 98.5 mmol·L-1)，置于密闭性良好的A/R装置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再换用模拟再灌注溶液(pH=7.4，NaH2PO4 0.9 mmol·L-1、KCl 5.0 mmol·L-1、NaHCO3 20.0 mmol·L-1、CaCl2 1.0 mmol·L-1、Hepes 20.0 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 mmol·L-1、Glu·H2O 1.2 mmol·L-1、NaCl 129.5 mmol·L-1)，复氧孵育2 h[9]，并通过检测LDH和CK来确定模型的构建是否成功。
1.4 VDAC1真核表达载体pFLAG-VDAC1在H9c2心肌细胞中的表达参照本实验室已建立方法，构建pFLAG-VDAC1质粒[9]，构建完成后，以空载质粒pFLAG为对照，进行重组质粒表达效率的检测，随后扩增、提取、纯化、转染至H9c2心肌细胞中。转染之前，弃去培养基，用不含血清的培养基漂洗细胞2次，换上新鲜的无抗生素、无血清的培养基，将质粒用Lipofectamine 2000TM脂质体转染至心肌细胞中，放入孵箱中继续培养。48 h后，裂解细胞，提取RNA和蛋白，利用Real-time PCR和Western blot分别检测VDAC1 mRNA和蛋白的表达水平。
1.5 实验分组实验共分4组：① Control组，正常培养不做处理；② A/R组，弃去培养基换用缺氧缺糖溶液，置于密闭装置中，通入含95% N2、5% CO2的混合气体缺氧孵育3 h；然后弃缺氧缺糖溶液，换用再灌注溶液，通入含95% O2、5% CO2的混合气体复氧孵育2 h；③葛根素组，加葛根素320 μmol·L-1孵育[9]，24 h后处理同A/R组；④ pFLAG-VDAC1-葛根素组，将重组质粒pFLAG-VDAC1转染至H9c2细胞中，24 h后处理同葛根素组。每组重复5次。
1.6 生化指标检测建模结束后，收集各组复氧液500 μL，根据试剂盒说明书检测LDH、CK活性。
1.7 VDAC1真核表达载体pFLAG-VDAC1转染效率的检测以空载质粒载体pFLAG为对照，将重组质粒pFLAG-VDAC1转染至H9c2细胞48 h后，裂解细胞，提取蛋白，Western blot检测VDAC1蛋白表达。
1.8 RNA提取和实时定量PCR(Real-time PCR)检测[8]采用TransZol试剂盒，提取各实验组细胞总RNA，使用逆转录酶合成cDNA，逆转成2 μg体系。实时荧光定量PCR仪进行扩增，使用Real-time PCR试剂盒按下列循环条件进行40个循环：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，10 s。VDAC1引物：上游5′-GACTGCTGTCAATCTCGCCT-3′，下游5′-GGAGTTGTTCACTTTGGCCG-3′；β-actin引物：上游5′-ATGACGATATCGCTGCGCTC-3′，下游5′-CAGTTGGTGACAATGCCGTG-3′。
1.9 Western blot检测H9c2心肌细胞VDAC1蛋白造模结束后，提取各组H9c2细胞总蛋白，取适量的蛋白提取液，利用BCA法进行浓度测定，定量上样蛋白总量，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，12%分离胶)，电泳结束后湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，4℃过夜孵育VDAC1、β-actin的一抗。洗膜液洗去未结合的一抗，后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床孵育2 h，ECL化学发光法检测。以β-actin为内参，标化相应组VDAC1的蛋白条带密度。
1.10 mPTP开放检测采用线粒体提取试剂盒，提取各组H9c2心肌细胞线粒体，通过线粒体肿胀实验检测mPTP的开放[10]。使用CaCl2诱导剂后，mPTP开放程度增加，则线粒体通透性逐渐增大，最终导致线粒体肿胀甚至破裂，此时吸光度明显下降。在520nm波长处，测各组吸光度初值(OD1)，记录此时数值，随后各实验组加200 μmol·L-1 CaCl2诱导剂，每分钟检测1次吸光度，直到约20 min后吸光度不再变化，记录此时吸光度值(OD2)，△OD=OD1-OD2。用△OD/min×1 000表示mPTP开放程度，此数值越大，表示mPTP开放程度越大。
1.11 Annexin V-FITC和PI双染色法检测H9c2心肌细胞凋亡Annexin V是分子量约为36 ku的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，当细胞受损发生早期凋亡时，磷脂酰丝氨酸由膜内移到膜外，Annexin V则可与之结合。碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一种DNA荧光染料，不能透过细胞膜，当细胞受损或坏死时细胞膜被破坏，PI透入胞核并嵌入双链DNA中发出红色荧光。将Annexin V用荧光素FITC标记，发出绿色荧光，以标记的Annexin V作为荧光探针。因此，常用Annexin V-FITC和PI双染色法区分不同凋亡时期的细胞。正常细胞：Annexin V(-)，PI(-)；凋亡中、晚期或坏死细胞：Annexin V(+)，PI(+)；早期凋亡细胞：Annexin V(+)，PI(-)。各组细胞用冷的1×PBS清洗2次，吸尽1×PBS，加入适量不含EDTA的胰酶消化细胞，用无血清培养基终止消化，离心收集细胞；再用冷的1×PBS洗涤细胞2次，加入500 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，另加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀后避光孵育15 min；最后加入5 μL PI染色液，混匀后避光孵育10 min，立即用流式细胞仪检测。
1.12 数据处理各实验组数据均以x±s表示，采用可重复的单因素方差分析进行组间比较。
2 结果 2.1 葛根素对A/R损伤后LDH、CK活性的影响当心肌细胞损伤时，LDH和CK由胞内释放到胞外。如Fig 1所示，与Control组相比，H9c2心肌细胞经A/R处理后，LDH、CK活性均明显提高(P < 0.05)，说明A/R模型构建成功；葛根素预处理组LDH、CK活性降低，但转染pFLAG-VDAC1重组质粒后，则可取消葛根素的保护作用。
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| Fig 1 Effect of puerarin treatment on LDH and CK activity in H9c2 subjected to A/R (x±s, n=5) C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs A/R group; △P < 0.05 vs Pue+A/R group. |
如Fig 2所示，空载质粒pFLAG组VDAC1蛋白水平与Control组相比，无明显改变，而pFLAG-VDAC1组VDAC1蛋白水平明显提高，说明重组质粒转染成功，并有效表达。
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| Fig 2 Western blot analysis of VDAC1 in H9c2 cells transfected with VDAC1 recombinant vector (x±s, n=5) C: Control group; pF: pFLAG group; pF-V: pFLAG-VDAC1 group. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs pF group. |
由Fig 3可知，与Control组相比，A/R组VDAC1 mRNA水平明显上调；葛根素预处理24 h可明显抑制VDAC1 mRNA的上调。
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| Fig 3 Real-time PCR analysis of VDAC1 mRNA expression in H9c2 subjected to A/R (x±s, n=5) C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group. ▲P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs A/R group; #P < 0.05 vs Pue+A/R. |
Fig 4的Western blot结果显示，A/R组VDAC1表达明显上调；葛根素预处理组的VDAC1表达水平较A/R组明显下调(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effect of puerarin treatment on the expression of VDAC1 in H9c2 cells exposed to A/R (x±s, n=5) C: Control group; A/R: A/R group; Pue+A/R: Pue+A/R group; pF-V-P: pFLAG-VDAC1-Pue group. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs A/R group; △P < 0.05 vs Pue+A/R group. |
当mPTP开放时，线粒体通透性增高，用200 μmol·L-1 CaCl2处理后，则进入线粒体而导致线粒体肿胀。如Fig 5所示，A/R组A520急剧下降，但葛根素预处理组则缓慢下降，△OD/min值较A/R组明显减小(P < 0.05)，说明mPTP开放受到抑制。而在pFLAG-VDAC1-葛根素组，线粒体A520变化与A/R组差异无统计学意义。
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| Fig 5 Effect of puerarin treatment on mPTP opening in H9c2 subjected to A/R (x±s, n=5) A: Original traces were shown for Ca2+-dependent mitochondrial swelling, monitored by the decrease in absorbance at 520 nm; B: Rate of mitochondrial swelling induced by 200 μmol·L-1 CaCl2. Data were shown as a change of A520(△D/min). *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs Pue+A/R group; △P < 0.05 vs A/R group. |
如Fig 6所示，H9c2心肌细胞经A/R处理后，与Control组比较，细胞凋亡数明显增加(P < 0.05)；葛根素预处理组细胞凋亡数明显减少(P < 0.05)；pFLAG-VDAC1-葛根素组细胞凋亡数增高，说明上调VDAC1表达可取消葛根素的保护作用。
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| Fig 6 Puerarin preconditioning could inhibited the apoptosis of cardiomyocytes suffered A/R(x±s, n=5) A: Representative flow cytometric dot plots (x-axis: Annexin V staining, y-axis: PI staining); B: Quantification of apoptotic cells population. *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs A/R group; #P < 0.05 vs Pue+A/R group. |
葛根素抗A/R损伤的作用已有研究[11-12]，其可通过调节PKCε蛋白、Bcl-2、Bax蛋白的表达发挥抗损伤作用。本文首次研究VDAC1与葛根素抗A/R损伤作用之间的关系，及其可能的分子机制。
mPTP是位于线粒体跨膜的非特异性孔道，正常情况处于关闭状态，是维持线粒体结构完整，实现其生理功能的必要条件。缺血期，Na+/K+-ATP酶失效，钠钙离子交换受阻，使得钙离子超载，线粒体氧化磷酸化抑制，ATP合成减少，乳酸堆积，导致细胞内的pH降低，mPTP处于关闭状态；再灌注期，恢复有氧呼吸，ATP合成增加，钙超载加重，活性氧大爆发，导致线粒体上mPTP不可逆开放[13]。mPTP开放将引起线粒体膜电位降低，直至崩溃，又由于基质肿胀和内膜伸展，随后引起外膜破裂，促凋亡因子由线粒体释放到胞质，激活下游凋亡蛋白，最终诱导细胞凋亡或坏死。因此，抑制mPTP的开放，可有效地抑制细胞凋亡或坏死，从而发挥抗损伤作用。本研究发现，A/R损伤后，mPTP开放，细胞凋亡明显增加；葛根素预处理后mPTP开放得到抑制，细胞凋亡减少，VDAC1高表达组则可取消葛根素抑制mPTP开放的作用，可认为葛根素通过抑制或者部分抑制mPTP开放来减少细胞凋亡。
VDAC1参与调控线粒体外膜通透性，控制离子和代谢物进出细胞，影响细胞凋亡；同时VDAC1也是Bcl-2家族的重要结合位点，它可与Bax/Bak相互作用形成孔径增大的孔道，使线粒体内的凋亡相关蛋白如细胞色素C等进入胞质，激活caspase-3，启动细胞凋亡的程序[15]。当细胞中VDAC1蛋白过表达时，会导致VDAC1由单体状态向多聚体状态发生转变，释放促凋亡蛋白到胞质，诱导细胞凋亡[14-15]。本研究结果表明，H9c2心肌细胞经A/R损伤后，VDAC1基因和蛋白水平均明显上调，细胞凋亡水平较高；葛根素预处理则可下调VDAC1的表达，细胞凋亡水平较低；而导入pFLAG-VDAC1质粒，上调VDAC1表达后，细胞凋亡水平较高，则说明取消了葛根素的保护作用，葛根素可能通过影响VDAC1的表达发挥抗A/R损伤的作用。
综上所述，我们推断，葛根素抗A/R损伤作用与VDAC1/mPTP机制密切相关。其通过下调VDAC1的表达，防止mPTP的过度开放，从而发挥保护作用。葛根素作为心血管保护药物，其可能涉及的分子机制还有待于进一步研究。
( 致谢: 本实验研究主要在南昌大学医学部江西省药理学重点实验室完成，感谢实验室人员的指导和帮助！)
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