2. 中山大学药学院药理毒理实验室，广东 广州 510006
2. Lab of Pharmacology and Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症，目前认为是一种慢性炎症、增殖反应性疾病[1]，是导致终末期肾衰竭的最常见原因。DN病变机制复杂，迄今尚未完全阐明。鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1, SphK1)信号通路与DN的关系近年来已成为研究的热点，SphK1是细胞生物学功能的重要调控分子，在肾间质纤维化过程中发挥肾脏保护作用[2]。研究表明，长期高血糖、糖基化终产物、氧化应激等均可激活SphK1，从而介导一系列炎症、增殖反应性疾病的发生、发展[3]。糖尿病状态下，SphK1活性增强，不但诱使肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖，还可进一步激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等核转录因子，从而介导细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、转化生长因子β1(transformation growth factor β1，TGF-β1)等纤维化成分明显增加[4-6]。说明DN早期已存在SphK1信号通路的激活。因此，抑制SphK1信号通路，可能成为防治DN发生、发展的一个重要靶标。
白藜芦醇(resveratrol，RSV)是我国传统治疗消渴病症(糖尿病及其慢性并发症)的中药虎杖中提取的一种二苯乙烯类化合物，是虎杖的主要活性成分，由于其功效独特、明显而副作用小，已广泛用于人类的生活保健之中。近年来的研究表明[7-9]，白藜芦醇具有抗DN的作用，但目前确切的分子作用机制尚不明确。最新研究显示[10-11]，白藜芦醇通过调节SphK1活性、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)表达，发挥抑制细胞增殖的作用。那么，白藜芦醇抗DN的作用是否与SphK1及下游核转录因子相关呢？目前尚未见到从影响SphK1/AP-1信号通路研究白藜芦醇抗DN作用机制的相关报道。本研究采用高糖诱导的GMC模型，观察白藜芦醇对模型细胞中与细胞增殖相关的成分FN、TGF-β1表达的影响，并进一步研究其对SphK1/AP-1信号通路的影响，以探讨白藜芦醇抑制GMC增殖、抗DN的确切分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)。
1.1.2 药物与试剂白藜芦醇购自北京伟业科创科技有限公司；SphK1抑制剂(SK-Ⅱ)，购自Merck-Millipore; D-(+)-葡萄糖、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、α-tubulin抗体，均购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone；DMEM培养基购自Gibco公司；FN一抗购自Santa Cruz Biotechnology; TGF-β1、SphK1一抗购自Cell Signaling Technolosy公司; 辣根过氧化物酶偶合的兔、鼠二抗购自Promega公司; AP-1探针购自上海碧云天生物技术有限公司；EMSA试剂盒购自Invitrogen公司；核蛋白提取试剂盒购自Active motif公司。
1.1.3 仪器双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；Elx-800型酶标仪(美国BioTek公司)；凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞的传代与培养HBZY-1常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃、饱和湿度5% CO2。每2~3 d用含0.03% EDTA的胰酶消化传代，传代后第3~12代的细胞用于实验。消化重悬的GMC稀释成相应的密度，接种至培养板或培养皿中常规培养，细胞生长近融合时，用无血清MEM培养基培养24 h后，再给予不同浓度的药物预处理2 h后，加入含高糖培养基刺激24 h后，收集细胞。
1.2.2 MTT法检测白藜芦醇对GMC细胞活力及增殖的影响GMC活力可反映GMC增殖的变化情况。以104/孔的密度将GMC细胞接种于96孔板中，按上述方法处理后，加入5、10、20 μmol·L-1 3个不同浓度的药物，每组设6个复孔。GMC培养结束前4 h，每孔加20 μL MTT工作液(5 g·L-1)，继续于37℃温箱培养4 h后，终止培养，小心吸弃孔内培养液，加入150 μL DMSO溶液，振荡混匀10 min，选择570 nm波长，在多功能酶标仪上检测各孔的吸光度值OD570nm，可间接反映GMC细胞数量的变化。
1.2.3 Western blot法检测GMC细胞中FN、TGF-β1、SphK1蛋白表达情况细胞终止培养后，弃孔内培养基，用冷PBS漂洗细胞2次，吸净PBS，加入去污裂解液，冰上用细胞刮子刮下细胞，收集裂解液至1.5 mL EP管，冰上静置30 min后，离心取上清，用BCA法测定蛋白含量。经5%浓缩胶、8%分离胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质，每孔上样20 μg总蛋白。用电转仪将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。电转后，TBST洗膜3次，每次5 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，FN一抗(1 :500)、TGF-β1一抗(1 :1 000)、SphK1一抗(1 :1 000)4℃孵育过夜，次日洗膜后，分别用对应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1 :5 000)室温孵育1 h，洗膜后加入化学发光剂显影。利用图像分析软件Quantity One对目的条带进行灰度分析。
1.2.4 EMSA法测定GMC细胞中AP-1的活性GMC处理结束后, 用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白，Braford方法测定蛋白质浓度后用于EMSA。生物素标记的AP-1探针序列如下:正向5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3';反向3'-GCGAACTACTGA GTCGGCCTT-5'。加入探针之前，将5 μg核蛋白与其他组分[50 mg·L-1 poly(dI-dC)、0.05% NP-40、5 mmol·L-1 MgCl2、2.5%甘油预先室温孵育10 min；加入2.0 μL AP-1标记探针，室温孵育20 min；反应体系中加入2.5 μL 5×loading buffer (总共15 μL体系)。7%非变性SDS-PAGE凝胶电泳之后，电转至尼龙膜，紫外交联10 min；封闭液室温封闭1 h后，加入稳定的链亲和素-辣根过氧化物酶交联物(1 :300)，与探针进行结合反应后，曝光，显影。
1.2.5 统计学分析数据采用Graphpad Prism5.0进行分析，组间和组内比较采用t检验，多组比较采用方差分析(单因素方差分析、LSD法)，结果采用x±s表示。
2 结果 2.1 白藜芦醇呈浓度依赖性地抑制GMC细胞增殖如Fig 1所示，与正常培养的GMC(含5.6 mmol·L-1 glucose, NG)相比，高糖培养24 h的GMC(含30 mmol·L-1 glucose, HG)可明显促进细胞的增殖(P < 0.05)，这与既往文献报道的结果一致[12]。用不同浓度的白藜芦醇对未加高糖刺激的正常培养的GMC干预24 h后发现，其对正常培养的GMC无明显影响，说明本实验中选用的5、10、20 μmol·L-1浓度的白藜芦醇对GMC没有毒性。与高糖培养的GMC相比，不同浓度的白藜芦醇预处理2 h后，再与高糖同处理24 h，可浓度依赖性地抑制高糖诱导的GMC增殖(P < 0.05)，其中20 μmol·L-1浓度抑制效应最佳。
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| Fig 1 Resveratrol inhibited high glucose-induced mesangial cell proliferation by MTT analysis(x±s, n=6) #P < 0.05 vs NG; *P < 0.05 vs HG |
如Fig 2所示, 与正常组相比，高糖刺激24 h可明显诱导GMC细胞中FN、TGF-β1、SphK1蛋白表达上调，不同浓度的白藜芦醇对高糖刺激的GMC中FN、TGF-β1、SphK1的蛋白表达均有抑制作用，且呈浓度依赖性。说明白藜芦醇可通过下调FN、TGF-β1、SphK1蛋白的表达，抑制GMC增殖。
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| Fig 2 Effects of resveratrol on FN, TGF-β1 and SphK1 protein expression in high glucose- induced mesangial cells(x±s, n=3) GMC was pretreated with different resveratrol for 2 h, and then stimulated by high glucose for further 24 h. #P < 0.05 vs NG; *P < 0.05 vs HG. |
通过Fig 2的结果，我们发现浓度为20 μmol·L-1的白藜芦醇可明显下调FN、TGF-β1、SphK1蛋白的表达，为探讨其下调与SphK1信号通路的关系，我们进一步用SphK1抑制剂SK-Ⅱ(10 μmol·L-1)进行干预，发现SK-Ⅱ也能明显抑制这些蛋白的表达(Fig 3)。说明白藜芦醇可能通过抑制SphK1信号通路，下调FN、TGF-β1的表达，从而达到抑制GMC增殖的目的。
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| Fig 3 Effects of resveratrol on FN and TGF-β1 protein expression by inhibition of SphK1 pathway(x±s, n=3) GMC was pretreated with 20 μmol·L-1 resveratrol or SK-Ⅱ for 2 h, and then stimulated by high glucose. #P < 0.05 vs NG; *P < 0.05 vs HG. |
与正常对照组相比，高糖刺激0.5 h即能明显增加AP-1的DNA结合活性，白藜芦醇和SphK1抑制剂SK-Ⅱ(10 μmol·L-1)预处理2 h均能明显降低AP-1的DNA结合活性(Fig 4)。提示白藜芦醇抑制FN、TGF-β1、SphK1表达的作用可能与其抑制核转录因子AP-1活化有关。
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| Fig 4 Effects of resveratrol on high glucose-induced activation of AP-1 in GMC GMC was pretreated with resveratrol or SphK1 inhibitor Ⅱ (SK-Ⅱ) at the indicated concentrations for 2 h, followed by addition of high glucose for half an hour. Nuclear extracts were subjected to EMSA to examine AP-1 DNA binding activity. |
大量研究表明，高血糖引起的GMC增殖及伴随发生的ECM积聚是糖尿病肾损害中早期最主要的病理改变，其过度增殖及纤维化在DN的进展中起着关键作用[13-14]。在本实验中，我们选择高糖培养GMC，模拟DN时体内的高血糖环境，而GMC长期暴露于高糖环境中，SphK1信号通路会被激活，从而促进下游核转录因子AP-1等的活化，进而影响AP-1调控的相关蛋白的表达[4, 6]。包括影响GMC增殖及纤维化的主要成分FN，因其具有可同时与ECM各类成分相结合、并促进ECM其他成分沉积的特点，常被作为评价ECM积聚程度、肾脏纤维化的一个重要指标。TGF-β1被认为是慢性肾脏纤维化过程中最重要的枢纽性细胞因子，很多发病机制如氧化应激损伤都可以通过TGF-β1实现最终的硬化结局。另外，FN、TGF-β1启动子区域有AP-1的结合位点，SphK1第一内含子有AP-1的作用元件。因此，在本研究中，我们选择SphK1/AP-1信号通路，探讨其对高糖培养的GMC细胞增殖的影响。白藜芦醇抗DN的作用被认为是多方面因素的结果，关于其与SphK1信号通路关系的研究，目前主要集中在抗肿瘤方面[7, 15]，而其抗DN作用是否也与该通路有关尚无报道。因此，我们在文献报道白藜芦醇的部分效应与其抗炎症损伤、抗氧化应激相关的基础上，进一步观察了白藜芦醇的上述效应与调节SphK1/AP-1信号通路的关系。
我们的研究结果显示，高糖环境下，GMC增殖较正常情况下明显增加，细胞内FN、TGF-β1、SphK1蛋白表达明显增强，核转录因子AP-1的DNA结合活性也明显增加，这与文献报道的结果相一致[4, 6]。而使用白藜芦醇和SphK1抑制剂干预后的GMC可明显扭转这一现象，白藜芦醇呈浓度依赖性地抑制GMC增殖，并降低高糖诱导的GMC中FN、TGF-β1、SphK1的高表达，同时抑制AP-1的活化；SphK1抑制剂也能明显降低FN、TGF-β1的表达、抑制AP-1的活化，提示白藜芦醇的上述作用机制可能与抑制SphK1/AP-1信号通路密切相关。研究结果为白藜芦醇防治DN提供了一定的实验基础及理论依据。那么，其是否同样影响关键酶SphK1催化生成的S1P及其受体的表达活性等，有待我们进一步完善相关研究。
( 致谢: 本实验在中山大学药学院药理与毒理学实验室完成，对参与实验的所有人员表示衷心的感谢！)
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