2. 成都医学院 检验医学院，四川 成都 610500
2. School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China
T细胞在机体特异性免疫应答中发挥着重要作用。T细胞正常的活化增殖是机体免疫应答的关键，但是T细胞的异常活化增殖，可能导致器官移植排斥反应，以及类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、肾病综合征等多种自身免疫性疾病的发生[1-3]。目前临床治疗此类疾病的方案常为免疫抑制剂，如环孢菌素A、环磷酰胺、贝拉西普、他克莫司(tacrolimus, FK506)和雷帕霉素(rapamycin, RAPA)。免疫抑制剂对T细胞异常活化增殖具有抑制作用，能有效缓解病情，减轻患者的痛苦[4]。但是，不同患者的药物敏感性存在明显个体差异，治疗过程中发现单一疗法效果不明显时，还需给予联合、轮换或序贯治疗。继续探索疾病的发病机制，发现更多的治疗靶点和全新结构的先导化合物，将为患者提供更多的选择与希望。
苯并恶唑是一类非常重要的含氮杂环化合物，它们衍生的化合物往往具有极高生物活性及药理活性，因此在医药和农药领域有着重要的作用。在医药方面, 苯并恶唑类化合物因具有消炎止痛、抗病毒[5]、抗肿瘤[6]、抗HIV[7]活性而被制成新型药剂。通过T细胞增殖抑制活性筛选平台，对小分子化合物进行细胞水平高通量筛选，发现苯并恶唑衍生物2-(苯并恶唑基-2基)-4, 5, 6, 7-四氢-2氢-吲唑-3-醇[2-(benzo[d]oxazol-2-yl)-4, 5, 6, 7-tetrahydro-2H-indazol-3-ol，PO-291]对T细胞增殖具有明显的抑制作用, 其结构见Fig 1。本实验对PO-291的作用机制进行初步的探索，为进一步开发疗效好、毒性小的新型免疫抑制剂提供思路。
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| Fig 1 Chemical structure of PO-291 |
苯并恶唑衍生物PO-291购自美国Chembridge公司; RPMI 1640培养基、FBS液，购自美国Gibco公司; FK506、雷帕霉素、碘化丙啶(propidium iodide, PI)购自美国Sigma-Aldrich公司; LY294002、AG-490购自美国Promega公司; 抗人CD3/CD28 Functional Grade Purified(Anti-CD3/CD28 mAbs)、抗人CD3-PE-cy、抗人CD25-PE-cy、抗人CD69-APC、人细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17，以及IFN-γ酶联检测试剂盒，均购自美国eBio-science公司; 5-羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)，购自美国Invitrogren公司; 人T细胞MACS磁珠分离试剂盒，购自德国Miltenyl Biotec公司; 人淋巴细胞分离液，购自挪威Axis-Shield POC公司; 细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒，购自南京凯基生物公司; p-STAT5、STAT5，p-p70S6K、p70S6K，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。
1.2 仪器Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司); 酶联免疫检测仪(美国BioTek公司); Ⅱ级A2型生物安全柜、细胞培养箱、小型台式离心机(美国Thermo公司); 倒置相差显微镜(日本Olympus公司); 全自动化学发光系统(美国Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 分离和纯化人T细胞根据先前的报道[8]分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。PBMCs培养于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640完全培养基中。使用人T细胞MACS磁珠分离试剂盒阴性分选出T细胞。分选后，通过流式细胞仪结合PE-anti-CD3染色对T细胞进行检测。此时T细胞纯度已达到95%，可用于后续实验。
2.2 CFSE标记分析根据先前文献所描述的方法[9]，采用5-羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)结合流式细胞术检测细胞的增殖情况。在37℃条件下，使用浓度为2.5 μmol·L-1的CFSE对人静息的T细胞(109 cells·L-1)、活化的T细胞(109 cells·L-1)和PBMCs (109 cells·L-1)进行10 min的染色，经PBS清洗2次后，重悬于含10% FBS的RPMI 1640完全培养基中。将被标记的静息T细胞，加入预先包被好抗CD3抗体(2 mg·L-1)并含可溶性抗CD28抗体(1 mg·L-1)的微孔板进行活化。再加入IL-2(10 μg·L-1)对被标记的活化T细胞进行诱导。采用源自另一人经过3 000 rad辐照的等同数量的PBMCs对被标记的PBMCs进行活化。在与不同浓度的PO-291共同培养72 h后，通过流式细胞术检测分别由anti-CD3/anti-CD28、IL-2和异体抗原活化的T细胞的增殖情况。不活化且不加药物的T细胞作为阴性对照(0%)，活化而不加药物的T细胞作为阳性对照(100%)。
2.3 细胞凋亡分析采用Annexin V和PI双染试剂盒检测PO-291对活化T细胞凋亡的影响。PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、雷帕霉素(RAPA 0.1 μmol·L-1)作用于经抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T细胞(109 cells·L-1) 24或48 h后。收集并清洗细胞，通过流式细胞术对细胞凋亡情况进行分析。
2.4 细胞活力分析PI染色检测细胞增殖活性。采用不同浓度PO-291 (0、10、20、40、80、160 μmol·L-1)处理人的静息T细胞(109 cells·L-1)和PBMC (109 cells·L-1) 72 h。使用流式细胞术结合PI染色对细胞活力进行分析。
2.5 CD25和CD69的表达PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、FK506 (0.1 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T细胞(109 cells·L-1)24 h后，收集细胞。并在4℃条件下，采用PE-anti-CD25和APC-anti-CD69对T细胞染色30 min，PBS清洗细胞，通过流式细胞术分析T细胞CD25和CD69的表达。
2.6 细胞周期分析PO-291(0、5、10、20 μmol·L-1)、RAPA(0.1 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化的T细胞(109 cells·L-1)72 h(加药不活化的细胞作为对照组)。收集细胞，根据Cycle test Plus DNA试剂盒说明书对细胞进行处理，采用流式细胞术对细胞进行分析。
2.7 细胞因子酶联免疫吸附分析不同浓度PO-291(0、5、10、20 μmol·L-1)、FK506 (0.1 μmol·L-1)、LY-294002(50 μmol·L-1)作用于抗CD3 (2 mg·L-1)和抗CD28(1 mg·L-1)活化的T细胞(109 cells·L-1)24或48 h。收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书，对细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ的分泌水平进行分析。
2.8 蛋白免疫印迹分析T细胞经抗CD3(2 mg·L-1)和抗CD28 (1 mg·L-1)活化72 h后，清洗并单独培养6 h。使用不同浓度PO-291 (0、10、20、40 μmol·L-1)、AG-490 (50 μmol·L-1)、RAPA (0.1 μmol·L-1)再培养T细胞6 h后，加入IL-2刺激细胞30 min。随后向细胞悬液中加入细胞裂解液，离心并分离出上清液。细胞裂解出的蛋白质(20 μg)在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，转至PVDF膜上。用含5% BSA的PBS对膜进行封闭，然后，将膜孵育于STAT5、phospho-STAT5、p70S6K、phospho-p70S6K一抗中4℃过夜，再孵育二抗1 h，最后对蛋白质进行可视化的增强化学发光。
2.9 统计学分析结果均以x±s表示。采用GraphPad Prism 6计算出药物的IC50。单因素方差分析法和Dunnet t检验法分析组间差异。
3 结果 3.1 PO-291体外抑制T细胞增殖且无明显细胞毒性为了探究PO-291的免疫抑制活性，采用CFSE分子标记法，结合流式细胞术检测PO-291作用于人T细胞增殖的机制。如Fig 2所示，PO-291对由抗CD3/抗CD28或同种异型抗原活化的T细胞增殖具有抑制作用，IC50分别为(8.09±1.04)μmol·L-1、(8.01±0.95)μmol·L-1。
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| Fig 2 T cell proliferation in vitro inhibited by PO-291(x±s, n=3) The CFSE-labeled T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20, 40, 80 μmol·L-1) and activated with anti-CD3/anti-CD28 (A, B) or allogeneic PBMCs (C) for 72 h. Cell proliferation was measured by flow cytometry. The cells without stimulator and PO-291 served as negative control (0%), while those with stimulator, but without PO-291 served as the positive control (100%). |
为了检验PO-291的抑制机制是由于免疫抑制活性，而并非细胞毒性，我们采用流式细胞术检测PO-291作用于人活化T细胞后细胞的凋亡情况，分析药物作用于静息T细胞和PBMC后细胞的增殖活性。如Fig 3所示，在完全抑制活化T细胞增殖的浓度下，24、48 h内PO-291均不诱导活化的T细胞凋亡，且不对静息的T细胞及PBMC的细胞活力产生较大的影响，说明PO-291具有明显的免疫抑制活性，且无明显细胞毒性。
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| Fig 3 No significant cytotoxicity of PO-291 in vitro(x±s, n=3) T cells were treated with PO-291 (10, 20, 40 μmol·L-1), RAPA (0.1 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 24 h or 48 h. Cell apoptosis was assessed by flow cytometry with Annexin V and PI dual staining (A). Nave T cells (B) and PBMC (C) were treated with PO-291 (10, 20, 40, 80, 160 μmol·L-1) or vehicle for 72 h. The flow cytometry with PI staining was used to assess the viability of cells. The cells without drug served as control (100%). |
CD25和CD69的表达，以及IL-2的分泌是T细胞活化的标志。与先前报道[10]类似，FK506明显抑制活化T细胞CD25和CD69的表达以及IL-2的分泌。本实验结果显示，PO-291不同于FK506，对CD25、CD69表达以及IL-2产生无明显影响(Fig 4)，说明PO-291对T细胞的活化无明显抑制作用。
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| Fig 4 T cell activation not inhibited by PO-291(x±s, n=3) T cells were treated with PO-291 (10, 20, 40 μmol·L-1), FK506 (0.1 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 24 h. The expression of CD25 and CD69 was analyzed on a flow cytometry (A, B). The supernatant was harvested and the level of IL-2 was assessed by ELISA (C). *P < 0.05 vs group of activated without drug. |
细胞周期的循环在细胞增殖中扮演了重要的角色[11]。为了探究PO-291对细胞周期循环的影响，我们采用流式细胞术检测T细胞内DNA在各细胞周期的含量。如Fig 5所示，与RAPA作用于T细胞的结果相似，PO-291使T细胞内DNA在G0/G1期的百分比明显增加，表明PO-291可诱导T细胞周期阻滞于G0/G1期。
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| Fig 5 T cell cycle arrest induced by PO-291 in G0/G1 phase(x±s, n=3) T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20 μmol·L-1) or RAPA (0.1 μmol·L-1) and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 72 h. Cell cycle progression was analyzed by flow cytometry. A: Representative flow cytometry histograms; B: Quantitative analysis of the percentages of cells in the G0/G1 phase. *P < 0.05 vs group of activated without drug. |
为了探究PO-291对促炎和抗炎细胞因子的影响，ELISA法检测了活化T细胞上清液中IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-2、IL-4、IL-10的分泌水平。如Fig 6所示，PO-291明显抑制活化T细胞中IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌，但对IL-2、IL-4、IL-10无明显影响。表明PO-291对调节性T细胞释放抗炎细胞因子无明显影响，但明显抑制Th1、Th17细胞释放促炎性细胞因子。
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| Fig 6 PO-291 inhibited proinflammatory cytokines production but not anti-inflammatory cytokines in activated T cells(x±s, n=3) T cells were treated with PO-291 (5, 10, 20 μmol·L-1), LY-294002 (50 μmol·L-1) or vehicle and activated with anti-CD3/anti-CD28 for 48 h. The supernatants were collected and the levels of IFN-γ (A), IL-6 (B), IL-17 (C), IL-2 (D), IL-4 (E) or IL-10 (F) were measured by ELISA.*P < 0.05 vs group of activated without drug. |
为了进一步揭示PO-291对T细胞增殖的调控机制，分别采用流式细胞术和蛋白免疫印迹法分析PO-291对由IL-2活化的T细胞的增殖和相关信号通路的影响。如Fig 7所示，IC50为(7.68±0.51)μmol·L-1时，PO-291抑制IL-2活化的T细胞的增殖。在PO-291的作用下，磷酸化STAT5明显减少，但磷酸化p70S6K表达增加。说明在相同条件下，PO-291对STAT5和p70S6K的表达无影响，但抑制STAT5磷酸化，且可增强p70S6K磷酸化，提示PO-291通过影响JAK3/STAT5信号通路，抑制T细胞增殖。
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| Fig 7 JAK3/STAT5 signaling pathway in IL-2-stimulated activated T cells affected by PO-291(x±s, n=3) The CFSE-labeled activated T cells were treated with PO-291 and stimulated by IL-2 for 72 h. Cell proliferation was measured by flow cytometry (A). The activated T cells were then treated with PO-291(10, 20, 40 μmol·L-1), AG-490 (50 μmol·L-1), RAPA (0.1 μmol·L-1) or vehicle for 6 h. Subsequently, T cells were induced by IL-2 for 30 min and the relative phosphorylation and expression levels of STAT5 (B) and p70S6K (C) were assessed by Western blot.*P < 0.05 vs control group. |
苯并恶唑是一类含氮杂环化合物，它们衍生的化合物常具有极高生物活性。我们前期合成了一系列苯并恶唑衍生物，通过T细胞增殖抑制活性筛选平台的高通量筛选，发现其中PO-291对T细胞活化增殖具有极强的抑制性。PO-291的IC50分别为(8.09±1.04)μmol·L-1、(8.01±0.95)μmol·L-1时，可明显抑制抗CD3/抗CD28或同种异型抗原活化的T细胞增殖。即使浓度达到160 μmol·L-1，也未观察到PO-291对人静息T细胞以及PBMC具有明显的细胞毒性。且在完全抑制活化T细胞增殖的药物浓度下，PO-291不对活化的T细胞产生诱导凋亡的作用。以上结果提示，PO-291对活化的T细胞增殖的抑制作用有选择性。静息T细胞接受CD3与CD28的双信号刺激后，通过激活钙调磷酸酶、MAPK、NF-κB 3条信号通路，使IL-2、CD25、CD69等分子表达，活化T细胞[12]。PO-291对IL-2、CD25、CD69的表达均无明显影响，提示PO-291可能作用于T细胞活化的后期阶段。T细胞活化后产生的IL-2与T细胞表面的CD25受体紧密结合，通过信号通路JAK3-STAT5、PI3K-Akt、mTOR-p70S6K等，向细胞内传递增殖信号，推动细胞周期进程，使细胞从G0/G1期进入S/M期，并开始增殖，形成正反馈环路[13]。PO-291不抑制活化的T细胞表达CD25、CD69以及分泌IL-2，但可使T细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，说明PO-291作用机制可能为阻断T细胞活化后期过程中的关键信号通路。本实验仅通过流式细胞术检测了药物PO-291对活化的T细胞周期的影响，而并未检测PO-291对调控细胞周期的蛋白的影响，我们将在下一步实验中探究调控细胞周期G0的蛋白如Cyclin D3、CDK6的变化。
活化的CD4+T细胞可向Th1、Th2、Th17或Treg分化[14]。Th1细胞分泌IFN-γ，Treg可分泌IL-10，IL-6是调控Th17分化的重要细胞因子，而Th17细胞可分泌IL-17。实验结果显示，PO-291对IL-4、IL-10的产生不具有明显影响，但明显抑制促炎细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17的产生。提示PO-291可能参与调节CD4+T细胞分化为Th1、Th2、Th17或Treg的过程。
在研究活化的T细胞JAK3/STAT5信号通路时，我们发现PO-291对STAT5的表达无影响，但可抑制磷酸化STAT5的表达，提示PO-291可能通过影响JAK3/STAT5信号通路来抑制T细胞增殖。查阅文献资料发现，低水平的STAT5对于p70S6K通路的持续激活是非常必要的[15]，若磷酸化STAT5受到抑制，磷酸化p70S6K的表达无影响或者同样受到抑制。而我们进一步研究活化的T细胞mTOR/p70S6K信号通路时，发现PO-291对p70S6K的表达无影响的情况下，抑制了磷酸化STAT5表达的同时，却增强了磷酸化p70S6K的表达。在后期查阅的大量文献中并未发现相关的报道，根据现有实验结果推测，JAK3/STAT5和mTOR/p70S6K两条信号通路之间存在某种关联，可使一条通路在受到药物抑制时，信号通过另一条信号通路进行传导。因此，下一步我们将进一步探究两条信号通路之间的关系，解答本实验中的疑惑，并且将继续探索PO-291可能作用的其他关键信号通路。
综上所述，苯并恶唑衍生物PO-291不影响T细胞的活化，但通过使细胞周期停滞于G0/G1期，对活化的T细胞增殖产生抑制。现阶段常见免疫抑制剂的结构与PO-291的结构迥异，也与现有处于临床试验阶段的新型化合物差异较大[16]。因此，PO-291有望作为先导化合物，为开发用于器官移植以及自身免疫性疾病的新型药物提供新的方向。
( 致谢: 本实验在成都医学院科研实验中心完成。感谢各位老师和同学对本实验提供的帮助与支持。)
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