糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的并发症之一，也是糖尿病患者死亡的重要原因[1-2]。肾血流动力学异常是DN早期的重要特点，表现为肾小球高压、高灌注和高滤过，这些异常情况长期存在使肾小球系膜基质及基底膜合成增加、降解减少，引起肾小球硬化，最终导致DN的发生[3]。肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMCs)位于肾小球毛细血管袢内，具有类似于血管平滑肌的多种功能，其收缩功能可通过改变毛细血管口径，影响肾小球血流量和滤过面积，调节肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR) [4]。已有报道，GMCs的功能失调与包括糖尿病慢性肾病在内的多种肾脏疾病相关[5-6]。
钙库操纵的钙内流(store-operated Ca2+ entry，SOCE)途径参与引起GMCs的Ca2+内流、产生收缩效应[4, 7]。Orai1和STIM1是SOCE的两种主要通道蛋白。我们前期研究证实，STIM1和Orai1表达于GMCs，利用siRNA干扰降低STIM1或Orai1表达可明显抑制原代培养的GMCs的SOCE水平[8]。Ca2+内流，引起局部Ca2+浓度升高，可迅速激活下游信号分子——大电导钙激活的钾通道(large conductance calcium activated potassium channel, BKCa)[9]。研究发现，BKCa也参与调节GFR[10]。但在GMCs中，SOCE与BKCa之间的相互关系以及高糖环境对其的影响并不清楚。本研究拟采用原代培养的大鼠GMCs作为研究对象，揭示GMCs中BKCa-Orai1之间是否存在物理性与功能性的相互作用，以及高糖培养模拟糖尿病对BKCa与Orai1在GMCs表达及其介导的功能的影响，从而为BKCa-Orai1相互作用在DN发病中的作用提供相关的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物清洁级♂SD大鼠，体质量(150~180) g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物实验严格遵照《实验动物质量管理方法》和《中华人民共和国实验动物管理条例》法规，并经安徽医科大学校动物伦理委员会同意。大鼠分笼饲养于室温(20~24) ℃的环境中，自由摄食与饮水。
1.1.2 试剂毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)和Iberiotoxin(IbTX)购于Sigma公司；Fluo-8/AM、Pluronic F-127购于Invitrogen公司；ECL显色试剂盒购于GE healthcare公司；Orai1抗体和BKCa抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI 1640、胎牛血清购于维森特生物技术有限公司；胰酶购于碧云天生物有限公司。
1.1.3 仪器钙成像荧光显微镜(日本尼康公司)；4℃低温离心机(美国Sigma公司)；低速离心机(湖南凯达科技仪器有限公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Bioshine Chemi Q 4600min化学发光成像系统(上海欧翔仪器有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 GMCs原代培养清洁级♂SD大鼠, 吸入过量CO2麻醉处死，消毒后打开腹腔，迅速取出两侧肾，移至超净台内4℃ PBS中, 去除肾包膜, 将肾皮质部分制成匀浆状, 依次经250、150、120 μm的不锈钢筛网滤过，最后收集120 μm筛网上的颗粒组织，得到肾小球悬液。1 000 r·min-1离心5 min后取沉淀物，加入5 mL含有0.1% Ⅰ型胶原酶的PBS, 震荡水浴箱内37℃孵育30 min, 显微镜下显示肾小球轻度破碎并松动，1 000 r·min-1离心5 min后取沉淀物，加入培养基悬浮，种植于25 cm2的细胞培养瓶中，1 h后更换新鲜培养基，去除杂质，细胞培养液含有RPMI 1640、10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素。
1.2.2 Western blot法检测蛋白表达水平分别采用正常糖培养基(5 mmol·L-1 D-glucose)和高糖培养基(25 mmol·L-1 D-glucose)培养GMCs，3 d后移除培养基，加入蛋白裂解液，冰上放置40 min，4℃下12 000 r·min-1离心20 min，留取上清液。以BSA为标准，用Bradford法对上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1 h；一抗4℃过夜。β-tubulin作为蛋白加样内参。反复洗膜后，二抗孵育，室温轻摇1 h，洗膜后，用ECL试剂盒对目的条带进行显影、采集图像，并用Quantity one软件分析测定各带吸光度(A)值作定量分析。
1.2.3 免疫共沉淀(co-immunopricipitaiton, co-IP)原代培养的GMCs加入细胞裂解液，置于冰上40 min，12 000 r·min-1、4℃离心20 min，留取上清液，分别加入3 μg一抗anti-BKCa或anti-Orai1抗体，4℃轻轻震荡2 h，加入Protein agarose A 100 μL，混合后，4℃轻轻震荡过夜。d 2，10 000 r·min-1、4℃离心2 min，弃上清，沉淀用细胞裂解液洗3次。加入100 μL细胞裂解液和50 μL三倍的上样缓冲液。100℃加热样品，离心5 min，上清用于蛋白电泳检测BKCa和Orai1的相互作用。
1.2.4 细胞内Ca2+浓度检测将消化后的GMCs接种于多聚赖氨酸包被后的玻片上，实验前用Fluo-8/AM(终浓度为6 μmol·L-1，且含有0.02% Pluronic F-127)在37℃培养箱中孵育细胞30 min后，用无钙PSS溶液(0 Ca2+-PSS：NaCl 140 mmol·L-1、MgCl2 1 mmol·L-1、KCl 5 mmol·L-1、EGTA 0.2 mmol·L-1、glucose 10 mmol·L-1、HEPES 4 mmol·L-1，pH 7.4)清洗玻片2遍后，将其安装在钙成像专用浴槽中，并向浴槽中加入500 μL 0 Ca2+-PSS，浴槽置于钙成像荧光显微镜，实时记录胞内游离Ca2+荧光信号。实验过程中，先在0 Ca2+-PSS加入TG(终浓度为2 μmol·L-1)作用于细胞耗竭钙库，激活钙库操纵的钙内流通道，然后加入Ca2+(终浓度为1 mmol·L-1)引起Ca2+内流，这一过程为SOCE，连续记录20 min。荧光强度反映的是游离钙离子的实时浓度，细胞内Ca2+浓度的变化用荧光相对强度之比(F1/F0)表示。
1.2.5 细胞膜电位记录如上细胞内Ca2+浓度检测实验，GMCs用100 nmol·L-1 DiBAC4(3)在室温黑暗处孵育10 min，玻片清洗后安装在专用浴槽中，并向浴槽中加入500 μL 0 Ca2+-PSS，浴槽置于钙成像荧光显微镜，实时记录DiBAC4(3)荧光信号。然后用2 μmol·L-1的TG在0 Ca2+-PSS溶液中处理10 min后，在细胞外液中加入Ca2+(使溶液Ca2+终浓度为2 mmol·L-1)，胞内荧光浓度的变化按荧光相对强度之比(F1/F0)进行计算。
1.3 统计学分析实验数据均采用Prism软件进行处理。所有资料以x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 SOCE引起GMCs膜超极化为检测SOCE对GMCs膜电位的影响，我们利用TG(2 μmol·L-1)耗竭GMCs内钙库，激活钙库操纵的钙通道，10 min后，外液中再加入Ca2+引起外钙内流。结果表明，SOCE可引起GMCs膜电位超极化，且BKCa的阻断剂IbTX(50 nmol·L-1)可以明显抑制SOCE引起的细胞膜超极化水平，说明SOCE引起的钙内流通过激活BKCa引起膜电位超极化(Fig 1)。
|
| Fig 1 Role of BKCa in SOCE-induced membrane hyperpolorization of rat GMCs A: Representative traces showed after treated with 2 μmol·L-1 thapsigargin (TG) for 10 min in 0 Ca2+-PSS, membrane hyperpolarization was evoked by 1 mmol·L-1 extracellular Ca2+ in GMCs with/without 50 nmol·L-1 iberiotoxin(IbTX); B: Summary of data showed changes in membrane hyperpolarization in response to extracellular Ca2+(n=4~5). *P < 0.05 vs control. |
我们前期实验已证实，Orai1参与介导GMCs的SOCE[8]。为验证SOCE主要通道蛋白Orai1与BKCa在大鼠GMCs上的相互作用，我们将原代培养的大鼠GMCs裂解后，提取蛋白进行免疫共沉淀实验。结果显示，Orai1蛋白与BKCa蛋白之间可以相互沉淀(Fig 2)。结果提示，Orai1与BKCa可能在GMCs上形成了信号复合物，从而使SOCE介导的局部钙浓度的变化可以更加精确、快速地调节细胞膜电位，进而通过负反馈调节控制细胞内的游离Ca2+浓度。
|
| Fig 2 Co-immunopricipitaion of Orai1 and BKCa in primary cultured rat GMCs (n=3) Representative images showed coimmunoprecipitation followed by immunoblots. A: Immunoblot with anti-Orai1 antibody; B: Immunoblot with anti-BKCa antibody. |
为进一步揭示高糖对GMCs的SOCE及其引起的膜电位超极化的影响，我们仍采用TG(2 μmol·L-1)耗竭钙库，激活钙库操纵的钙通道，外液中再加入Ca2+引起外钙内流(Fig 1 A)。GMCs经高糖培养3 d后，SOCE引起细胞内Ca2+水平升高增强(Fig 3)，而SOCE引起的细胞膜去极化绝对值也增大(Fig 4)。推测这一改变可能与SOCE的主要组成蛋白Orai1和BKCa通道蛋白表达水平的变化有关。
|
| Fig 3 Effect of high glucose(HG) on store-operated Ca2+entry (SOCE) in GMCs A: Representative SOCE traces was evoked by Ca2+ response in GMCs with normal glucose(NG) and high glucose(HG) treatment for 3 days; B: Summary data showed effect of NG and HG in GMCs(n=4~5). *P < 0.05 vs NG treatment. |
|
| Fig 4 Role of high glucose in SOCE-induced membrane hyperpolorization of rat GMCs A: Representative traces showed after treatment with 2 μmol·L-1 TG for 10 min in 0 Ca2+-PSS, membrane hyperpolarization was evoked by 1 mmol·L-1 extracellular Ca2+ in GMCs with NG or HG; B: Summary of data showed changes in membrane hyperpolarization in response to extracellular Ca2+ (n=4~5). * P < 0.05 vs NG treatment. |
为揭示高糖引起的细胞Ca2+水平和膜电位变化的原因，我们进一步检测了高糖培养对SOCE主要通道蛋白Orai1和下游信号分子BKCa的表达水平的影响。结果显示，与正常糖培养相比较，原代培养的GMCs高糖处理3 d后，Orai1和BKCa的表达水平均明显升高(Fig 5)。
|
| Fig 5 Changes of Orai1 and BKCa protein expression induced by high glucose in rat primary cultured GMCs (x±s, n=4) *P < 0.05 vs NG treatment |
血管紧张素Ⅱ、血管升压素、内皮素-1等血管活性物质都可通过SOCE途径，引起GMCs的Ca2+内流、产生收缩效应[4, 7]。SOCE通过细胞内钙库的充盈与排空进行调控。当胞内钙库排空，位于内质网膜上的STIM1蛋白N端的钙感受器被激活，发生结构改变并形成多聚体，位于胞质的C端与细胞膜上的Orai1相互作用，激活Orai1通道，引起SOCE[11]。我们前期研究证实，STIM1和Orai1表达于GMCs，并参与介导SOCE[8]。另外，研究发现，BKCa参与调节GFR[10]。在BKCa β1亚单位敲除小鼠，基础状态下GFR是正常的，但在血容量增多时，却无法像野生型小鼠一样出现GFR相应增加。从血流动力学方面分析，这种改变可能是因为表达于肾小球入球小动脉[12]和GMCs的BKCa功能异常所致[13]。然而研究表明，在肾小球入球小动脉，BKCa所发挥的抑制血管收缩的作用相对较弱[12]，而GMCs的BKCa在对抗其收缩中则发挥主要作用[13]。所以，当敲除BKCaβ1亚基时，BKCa的负反馈调节作用减弱，引起持续的Ca2+内流和GMCs收缩，肾小球滤过面积减小，导致GFR无法根据血容量的增加而增大。
本实验结果显示，在GMCs中，SOCE可以引起细胞超极化，这与Ca2+内流引起膜的去极化的设想不同，说明SOCE激活了其他的通道参与这一过程。进一步的研究发现，BKCa阻断剂IbTX可以明显抑制SOCE引起的细胞膜超极化水平。在细胞信号转导过程中，为了快速、高效地激活下游分子，细胞中参与同一信号转导的几种分子可形成复合物。BKCa既然是SOCE介导的Ca2+内流所激活的下游分子，那么是否可与SOCE通道蛋白形成信号复合物呢？我们利用co-IP检测发现，BKCa可与Orai 1相互沉淀，提示BKCa与Orai 1形成了复合物。根据这些实验结果，推测SOCE介导的钙内流可以通过引起局部Ca2+浓度升高，迅速激活下游信号分子BKCa通道，引起K+外流、细胞膜超极化，形成负反馈而抑制电压依赖性钙通道(voltage-dependence calcium channel, VDCC)，导致Ca2+内流减弱，可能参与调节细胞的收缩反应[10]。
糖尿病患者早期肾脏病理改变可能与SOCE功能改变，引起的胞内Ca2+信号异常有关。研究发现，模拟糖尿病微环境的高糖处理可引起GMCs凋亡等改变[14]。最近有研究发现，高糖处理增加SOCE水平和SOCE主要蛋白Orai1、STIM1的表达水平[15]。我们的实验结果发现，在高糖培养3 d后，SOCE的主要通道蛋白Orai1的表达水平和介导的钙内流明显加强，且SOCE引起的GMCs的膜超极化幅度明显增大，继续探究Orai1与BKCa通道蛋白表达水平发现，高糖培养GMCs 3 d增加Orai1与BKCa的表达水平。这些结果提示，高糖培养通过增加Orai1表达水平而使SOCE介导的钙内流增强，并更加高效地激活同样高表达的下游信号分子BKCa通道，引起GMCs膜电位进一步超极化，从而抑制VDCC。这一机制可能参与了肾小球在糖尿病初期功能异常所引起的GFR的改变。但在糖尿病不同时期，GFR的变化有所不同，机制也不尽相同，关于钙信号在糖尿病不同时期对系膜细胞与GFR的影响还有待进一步探讨。
| [1] | Zac-Varghese S, Winocour P. Managing diabetic kidney disease[J]. Br Med Bull, 2018, 125(1): 55-6. doi:10.1093/bmb/ldx047 |
| [2] | Romagnani P, Remuzzi G, Glassock R, et al. Chronic kidney disease[J]. Nat Rev Dis Primers, 2017, 3: 17088. doi:10.1038/nrdp.2017.88 |
| [3] | Moriya T, Tsuchiya A, Okizaki S, et al. Glomerular hyperfiltration and increased glomerular filtration surface are associated with renal function decline in normo- and microalbuminuric type 2 diabetes[J]. Kidney Int, 2012, 81(5): 486-93. doi:10.1038/ki.2011.404 |
| [4] | Abboud H E. Mesangial cell biology[J]. Exp Cell Res, 2012, 318(9): 979-85. doi:10.1016/j.yexcr.2012.02.025 |
| [5] | Frische S. Glomerular filtration rate in early diabetes: ongoing discussions of causes and mechanisms[J]. J Nephrol, 2011, 24(5): 537-40. doi:10.5301/jn.5000009 |
| [6] | Barton M, Sorokin A. Endothelin and the glomerulus in chronic kidney disease[J]. Semin Nephrol, 2015, 35(2): 156-67. doi:10.1016/j.semnephrol.2015.02.005 |
| [7] | Ma R, Du J, Sours S, et al. Store-operated Ca2+ channel in renal microcirculation and glomeruli[J]. Exp Biol Med, 2006, 231(2): 145-53. doi:10.1177/153537020623100204 |
| [8] | Shen B, Zhu J, Zhang J, et al. Attenuated mesangial cell proliferation related to store-operated Ca2+ entry in aged rat: the role of STIM 1 and Orai 1[J]. Age (Dordr), 2013, 35(6): 2193-202. doi:10.1007/s11357-013-9511-5 |
| [9] | Ma R, Pluznick J L, Sansom S C. Ion channels in mesangial cells: function, malfunction, or fiction[J]. Physiology, 2005, 20: 102-11. doi:10.1152/physiol.00050.2004 |
| [10] | Kudlacek P E, Pluznick J L, Ma R, et al. Role of hbeta1 in activation of human mesangial BK channels by cGMP kinase[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2003, 285(2): F289-94. doi:10.1152/ajprenal.00046.2003 |
| [11] | Soboloff J, Rothberg B S, Madesh M, et al. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(9): 549-65. doi:10.1038/nrm3414 |
| [12] | Fallet R W, Bast J P, Fujiwara K, et al. Influence of Ca2+-activated K+ channels on rat renal arteriolar responses to depolarizing agonists[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2001, 280(4): F583-91. doi:10.1152/ajprenal.2001.280.4.F583 |
| [13] | Stockand J D, Sansom S C. Role of large Ca2+-activated K+ channels in regulation of mesangial contraction by nitroprusside and ANP[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 1996, 270: C1773-9. doi:10.1152/ajpcell.1996.270.6.C1773 |
| [14] | 刘静, 张瑞, 李冠青, 史永红. SRT1720对高糖诱导的小鼠系膜细胞凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(8): 1164-9. Liu J, Zhang R, Li G Q, Shi Y H. Influence of STI1720 on apoptosis of high glucose induced mouse mesangial cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(8): 1164-9. |
| [15] | Chaudhari S, Wu P, Wang Y, et al. High glucose and diabetes enhanced store-operated Ca2+ entry and increased expression of its signaling proteins in mesangial cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2014, 306(9): F1069-80. doi:10.1152/ajprenal.00463.2013 |