2. 山东中医药大学基础医学院，山东 济南 250355;
3. 广东药科大学中药学院中药药理学教研室，广东 广州 510006
2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
3. Dept of Pharmacology, School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
资料显示，抑郁发病率逐年增高，目前全球约有15%的人受抑郁困扰[1]。海马在情绪调节中发挥重要作用，研究表明，海马NF-κB信号通路过度激活与抑郁的发生、发展密切相关。已证实，调节过度激活的海马NF-κB信号通路可减轻抑郁动物模型的抑郁行为[2]。黄芪是一种具有多种药理活性的中药，黄芪及其提取物在抑郁的治疗中应用已久[3-4]。黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)是黄芪的提取物之一，具有神经保护、抗炎、抗氧化等多种活性。研究显示，APS对哮喘、糖尿病等多种动物模型的NF-κB通路活性具有抑制作用[5]。但APS是否具有抗抑郁作用？对抑郁机体海马NF-κB信号通路活性有何影响？均未见报道。本研究拟就上述问题进行探索，观察APS对大鼠抑郁行为的影响，并探索其可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♂Wistar大鼠40只，体质量(200±20)g，购自鲁抗集团，动物合格证号: SCXK鲁20130001。
1.1.2 药品与试剂APS(惠州市东方植物保健科技有限公司)；NF-κB p65酶联免疫试剂盒、p-NF-κB p65、p-IκBα一抗(美国Cell Signaling公司)；羊抗兔IgG(武汉博士德公司)；TranAMTM NF-κB p65转录因子分析试剂盒(美国Active Motif公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫试剂盒(武汉华美公司)。
1.1.3 仪器酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Morris水迷宫(上海软隆科技发展有限公司)；电泳仪、转印仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)。
1.2 方法 1.2.1 模型制备及药物干预大鼠随机分为正常组、抑郁组、APS高、低剂量组，每组10只。抑郁组、APS高、低剂量组大鼠采用经典的慢性轻度不可预见性应激法(chronic unpredictable mild stress, CUMS)诱导抑郁行为。应激因素包括：热刺激(45℃)，冷水游泳(4℃，5 min)，饮水剥夺(48 h)，饮食剥夺(48 h)，夹尾(180 s)，躯体束缚(1 h)，电击足底(电压30 V，120 s，每电击15 s间歇5 s)，昼夜颠倒，闪光刺激，倾斜鼠笼、潮湿垫料、单笼饲养等居住环境改变，噪音干扰(2 h)等，共刺激4周。正常组不予以应激刺激。APS高、低剂量组大鼠在接受CUMS刺激的同时，分别给予APS 400、200 mg·kg-1·d-1灌胃给药，每日1次，连续用药4周；正常组、抑郁组大鼠给予相同体积的生理盐水。
1.2.2 糖水摄取实验根据文献[6]，在测试前，先给予大鼠1%蔗糖水24 h，训练动物适应含糖的饮水。测试过程：大鼠禁水24 h后，单笼饲养，并给予每只大鼠两瓶外观相同的饮水，一瓶为纯水，一瓶为1%蔗糖水，留置12 h，计算每瓶液体的摄取量，计算糖水摄取量占总液体摄取量的百分比。
1.2.3 强迫游泳实验根据文献[6]，将大鼠置于游泳设备内，留置5 min，将大鼠游泳活动录像，并计数大鼠在水面静止不动时间。测试前1 d，将大鼠置于游泳设备内15 min，训练大鼠适应游泳测试容器。
1.2.4 旷场实验根据文献[6]，将大鼠置于敞箱中心格内(敞箱大小为100 cm×100 cm×80 cm，内壁涂为黑色，底面均分为25格)，大鼠在敞箱内自由活动5 min，录像并计数大鼠水平活动及垂直活动得分。测试每只大鼠前，均用乙醇彻底清洁敞箱。
1.2.5 Western blot分析处死大鼠，取新鲜海马组织，提取总蛋白，上样40 μg，电泳分离后转移至硝酸纤维素膜，室温下用10%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h，一抗(p-NF-κB-p65、p-IκBα稀释度为1 :1 000)4℃孵育过夜，TBST漂洗10 min×3次，二抗(1 :10 000)37℃孵育2 h，漂洗3次，显影，采用化学发光成像系统进行检测分析，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度/β-actin条带灰度。
1.2.6 NF-κB p65 DNA结合活性检测取部分海马组织，提取核蛋白，利用TranAMTM NF-κB p65转录因子分析试剂盒，检测NF-κB p65 DNA结合活性。
1.2.7 ELISA检测将部分海马组织匀浆，离心后取上清液冻存。采用ELISA法检测海马组织中NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
1.2.8 统计学处理数据采用x±s表示，用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，各组数据进行单因素方差分析，组间差异采用q检验进行比较。
2 结果 2.1 APS对大鼠糖水摄取量的影响如Tab 1所示，与正常组比较，抑郁组大鼠糖水摄取量明显减少(P < 0.05)。与抑郁组比较，APS低、高剂量组大鼠糖水摄取量均明显增增加(P < 0.05)，且高剂量组大鼠糖水摄取量高于低剂量组(P < 0.05)。
| Group | Sucrose intake/% | Immobility time/s | Crossings | Rearings |
| Control | 83.25±6.73 | 59.30±7.02 | 90.51 ±12.02 | 37.14 ± 4.30 |
| Model | 46.90±6.14* | 180.22±14.69* | 62.37±8.33* | 24.68±4.11* |
| APS 200 mg·kg-1 | 59.49±4.25# | 137.91±10.02# | 66.82±7.04# | 26.07±3.51# |
| APS 400 mg·kg-1 | 70.16±5.05#△ | 103.31±11.58#△ | 69.53±5.80# | 27.59±3.92# |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs model; △P < 0.05 vs APS 200 mg·kg-1 | ||||
Tab 1结果显示，强迫游泳实验中，与正常组比较，抑郁组大鼠静止不动时间明显延长(P < 0.05)。APS低、高剂量组大鼠静止不动时间均较抑郁组明显缩短(P < 0.05)，且高剂量组大鼠静止不动时间短于低剂量组(P < 0.05)。
2.3 APS对大鼠自主活动的影响旷场实验中(Tab 1)，与正常组比较，抑郁组大鼠水平活动及垂直活动得分均明显减少(P < 0.05)。APS低、高剂量组大鼠自主活动与抑郁组无明显区别(P>0.05)。
2.4 APS对海马NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα表达的影响如Tab 2、Fig 1所示，与正常组比较，抑郁组大鼠海马NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平明显升高(P < 0.05)。APS低、高剂量组大鼠海马上述物质水平均明显低于抑郁组(P < 0.05)，且高剂量组水平低于低剂量组(P < 0.05)。
| Group | NF-κB p65/ng·L-1 | TNF-α/ng·L-1 | IL-1β/ng·L-1 | IL-6 /ng·L-1 |
| Control | 22.90±3.11 | 27.29±4.20 | 18.34±2.61 | 23.62±3.16 |
| Model | 63.02±5.19* | 69.33±7.14* | 48.79±6.22* | 60.09±8.73* |
| APS 200 mg·kg-1 | 48.78±6.34# | 55.08±5.02# | 36.02±4.40# | 45.16±4.04# |
| APS 400 mg·kg-1 | 36.15±3.20#△ | 45.53±3.31#△ | 28.30±3.15#△ | 35.37±4.53#△ |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs model; △P < 0.05 vs APS 200 mg·kg-1 | ||||
|
| Fig 1 Effects of APS on levels of p-NF-κB p65 and p-IκBα(x±s, n=6) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs APS 200 mg·kg-1 group |
如Fig 2所示，与正常组比较，抑郁组大鼠NF-κB p65 DNA结合活性明显升高(P < 0.05)。APS低、高剂量组大鼠NF-κB p65 DNA结合活性均明显低于抑郁组(P < 0.05)，且高剂量组NF-κB p65 DNA结合活性低于低剂量组(P < 0.05)。
|
| Fig 2 Effects of APS on NF-κB p65 DNA binding activity (x±s, n=10) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs APS 200 mg·kg-1 group |
Tab 2结果显示，与正常组比较，抑郁组大鼠海马TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高(P < 0.05)。与抑郁组比较，APS低、高剂量组大鼠海马TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P < 0.05)，且高剂量组上述因子的水平较低剂量组进一步下降(P < 0.05)。
3 讨论目前常用的治疗抑郁的药物以西药为主，包括单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药、杂环类抗抑郁药等，其中多数药物具有较为突出的不良反应。近年，国内外学者在传统药物及其提取物治疗抑郁症方面进行了大量研究，发现多种提取物具有抗抑郁作用[7]，为抗抑郁药的发现开辟了新的途径。黄芪及其提取物在抑郁的治疗中应用已久[3-4]。APS是黄芪的提取物之一，具有抗炎、神经保护等多种药理活性，但其是否具有抗抑郁活性未见报道。
本研究采用CUMS法制备抑郁大鼠模型，并给予APS治疗，治疗后对动物行为学进行了评价。强迫游泳实验被广泛用于抗抑郁药物的疗效评价，其中静止不动时间代表抑郁动物的绝望程度[6]。本研究结果显示，CUMS明显延长了强迫游泳实验中大鼠的静止不动时间，而APS明显缩短了抑郁大鼠的静止不动时间，说明APS对大鼠具有抗抑郁作用。快感缺乏是抑郁的另一项重要表现，糖水消耗实验被广泛用于评价抑郁动物的快感缺乏程度[6]。本研究结果显示，CUMS明显减少了大鼠的糖水摄取量，而APS明显增加了抑郁大鼠的糖水摄取量，该实验结果进一步验证了APS具有抗抑郁活性。文献显示，抑郁动物的自主活动情况会影响在抑郁评价实验中的行为，从而引起实验误差[8]。为排除APS可能通过改变大鼠的自主活动而干扰抗抑郁行为的评价结果，本文通过旷场实验观察了APS对大鼠自主活动的影响。结果显示，APS未改变大鼠的自主活动，该结果表明APS治疗后，大鼠行为学的改善的确源于APS的抗抑郁作用，而未受大鼠自主活动影响。与本研究结果类似，Liu等[9]研究显示多种药物在发挥抗抑郁作用时，对动物的自主活动无明显影响。
目前抑郁症发病机制尚未完全明了，大量研究显示，转录因子NF-κB参与了抑郁的发生与发展[2]。NF-κB包括Rel、p65、RelB、p50、p52等5个亚单位，其中p65在与DNA结合、转录活化中发挥重要作用。在未激活状态时，NF-κB与IκB结合形成复合体，IκB限制了NF-κB向细胞核移位。在外界某些信号的刺激下，IκB发生磷酸化反应，IκB转变为磷酸化IκB(p-IκB)，从而导致IκB失活，解除了对NF-κB的抑制，NF-κB进入核内与特异的κB序列结合，诱导其调控的基因进行转录。NF-κB在调节炎症反应方面发挥重要作用，近年研究表明抑郁的发生与炎症反应密切相关。大量文献显示，抑郁机体NF-κB信号通路被过度激活，而利用药物抑制NF-κB的过度激活，可减轻抑郁模型动物的抑郁行为[2, 10]。NF-κB对抑郁的影响可能与其引起的炎症反应，干扰了中枢情绪调节有关。海马在情绪调节中发挥重要作用，本研究显示，CUMS明显升高了大鼠海马NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并增加了NF-κB p65 DNA结合活性。其他研究也发现，CUMS可激活动物NF-κB信号活性[11]，与本研究结果一致。APS明显降低了抑郁大鼠海马NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα水平，并降低了其NF-κB p65 DNA结合活性，表明APS可明显抑制CUMS引起的NF-κB信号过度激活。由此推断，APS的抗抑郁作用可能与抑制大鼠海马NF-κB活性有关。与本文APS对NF-κB的影响类似，另有文献显示，APS可抑制哮喘、结肠炎动物模型体内NF-κB信号通路，从而发挥治疗作用[5, 12]。
NF-κB对机体的影响是通过其调控的下游效应分子实现的[13]。TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子是NF-κB信号通路的重要下游分子，在炎症反应等病理过程中发挥重要作用。研究表明，抑郁患者及抑郁动物模型上述细胞因子均较正常水平明显升高。TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高与抑郁发展的关系已被大量文献证实，许多以降低上述因子水平为目标的治疗方案，均显示了良好的抗抑郁作用[14]。本研究结果显示，CUMS明显升高了大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，这与既往文献报道一致。经APS干预后，与对NF-κB的作用一致，APS明显降低了抑郁大鼠海马TNF-α、IL-1β、IL-6水平，这进一步验证了APS对NF-κB信号通路具有抑制作用。结合文献及本研究结果，推论APS的抗抑郁作用可能与抑制抑郁大鼠海马的NF-κB下游细胞因子有关。除本研究外，APS的抗炎作用已被大量报道，资料显示，APS可明显降低哮喘、心肌肥厚等动物模型的多种细胞因子水平，从而发挥治疗作用[5, 15]。
综上所述，APS可减轻CMUS诱发的大鼠抑郁行为，其抗抑郁作用可能与抑制CUMS诱发的NF-κB激活信号通路过度激活有关。
( 致谢: 本研究在潍坊医学院应用药理学实验室(山东省重点实验室)完成。)
| [1] | Global Burden of Disease Study 2013 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013[J]. Lancet, 2015, 386(9995): 743-800. doi:10.1016/S0140-6736(15)60692-4 |
| [2] | Zhu L, Nang C, Luo F, et al. Esculetin attenuates lipopolysaccharide (LPS)-induced neuroinflammatory processes and depressive-like behavior in mice[J]. Physiol Behav, 2016, 163: 184-92. doi:10.1016/j.physbeh.2016.04.051 |
| [3] | 丁艳平, 马丽梅, 李艳萍. 黄芪注射液对慢性应激抑郁模型大鼠行为及海马区SOD活力和MDA含量的影响[J]. 西北师范大学学报(自然科学版), 2011, 47(6): 75-9. Ding Y P, Ma L M, Li Y P, et al. The effects of astragalus injection on the behavior and SOD activity and MDA content of hippocampus in chronic stress depression rats[J]. J Northwest Normal Univ (Nat Sci), 2011, 47(6): 75-9. |
| [4] | 艾群, 张建华, 田舸, 等. 黄芪穴位缓释埋植剂对慢性应激抑郁模型大鼠行为学影响[J]. 大连医科大学学报, 2010, 32(4): 405-7. Ai Q, Zhang J H, Tian G, et al. Effects of astragalus-implant on actions of mice with chronic unpredictable mild stress depression[J]. J Dalian Med Univ, 2010, 32(4): 405-7. doi:10.11724/jdmu.2010.04.07 |
| [5] | 王金磊, 李承德, 孙宏伟, 等. 黄芪多糖抑制NF-κB/MAPK信号通路和改善哮喘大鼠气道炎症的作用[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(4): 489-93. Wang J L, Li C D, Sun H W, et al. Astragalus polysaccharide regulates NF-κB/MAPK signaling pathway and attenuates airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(4): 489-93. |
| [6] | Xu J, She Y, Su N, et al. Effects of electroacupuncture on chronic unpredictable mild stress rats depression-like behavior and expression of p-ERK/ERK and p-p38/p38[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015, 2015: 650729. |
| [7] | Ge L, Liu L, Liu H, et al. Resveratrol abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior, neuroinflammatory response, and CREB/BDNF signaling in mice[J]. Eur J Pharmacol, 2015, 768: 49-57. doi:10.1016/j.ejphar.2015.10.026 |
| [8] | Yang X H, Song S Q, Xu Y. Resveratrol ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior: involvement of the HPA axis, inflammatory markers, BDNF, and Wnt/β-catenin pathway in rats[J]. Neuropsychiatr Dis Treat, 2017, 13: 2727-36. doi:10.2147/NDT |
| [9] | Liu S Y, Li D, Zeng H Y, et al. Hydrogen sulfide inhibits chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior by upregulation of Sirt-1: involvement in suppression of hippocampal endoplasmic reticulum stress[J]. Int J Neuropsychopharmacol, 2017, 20(11): 867-76. doi:10.1093/ijnp/pyx030 |
| [10] | Zhang Y, Zhao Y, Pan F, et al. EGb761 attenuates depressive-like behaviours induced by long-term light deprivation in C57BL/6J mice through inhibition of NF-κB-IL-6 signalling pathway[J]. Cent Eur J Immunol, 2016, 41(4): 350-7. |
| [11] | Pesarico A P, Sartori G, Brüning C A, et al. A novel isoquinoline compound abolishes chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in mice[J]. Behav Brain Res, 2016, 307: 73-83. |
| [12] | Lv J, Zhang Y, Tian Z, et al. Astragalus polysaccharides protect against dextran sulfate sodium-induced colitis by inhibiting NF-κВ activation[J]. Int J Biol Macromol, 2017, 98: 723-9. doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.02.024 |
| [13] | 雷升萍, 王靓, 龙子江, 等. 黄精多糖通过TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制缺氧/复氧H9c2心肌细胞炎性因子释放[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(2): 255-60. Lei S P, Wang L, Long Z J, et al. Inhibitory effect of polygonatum sibiricum polysaccharides on release of inflammatory cytokines of anoxia/ reoxygenation H9c2 myocardial cells through TLR4 MyD88 NF-κB signaling pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(2): 255-60. |
| [14] | Kopschina Feltes P, Doorduin J, Klein H C, et al. Anti-inflammatory treatment for major depressive disorder: implications for patients with an elevated immune profile and non-responders to standard antidepressant therapy[J]. J Psychopharmacol, 2017, 31(9): 1149-65. doi:10.1177/0269881117711708 |
| [15] | Han R, Tang F, Lu M, et al. Protective effects of Astragalus polysaccharides against endothelial dysfunction in hypertrophic rats induced by isoproterenol[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 38: 306-12. doi:10.1016/j.intimp.2016.06.014 |