2. 安徽医科大学生物化学教研室，安徽 合肥 230032
2. Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
由于全球肥胖或超重人群的逐年增加，导致胰岛素抵抗、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等代谢性疾病的发病率明显上升[1]。新一代的降糖药胰高血糖素样肽-1类似物(glucagon-like peptide-1 analogues，GLP-1A)因具有独特的降糖机制、安全有效的降糖效果及减轻体重的特点，成为内分泌代谢病领域的研究热点。目前临床上常用的GLP-1A包括利拉鲁肽(liraglutide，LRG)、艾塞那肽、阿必鲁泰等。
成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是一种新型的代谢调控分子，在包括肝脏、脂肪组织、胰腺等多个组织中都有表达，通过与辅助受体β-Klotho及FGF受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)结合，实现调控糖脂代谢的功能[2]。Chau等[3]研究表明，FGF21通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，增强线粒体氧化作用来调控脂肪细胞的能量平衡。GLP-1A可通过影响FGF21水平发挥作用。Yang等[4]报道，注射高剂量的利拉鲁肽(1 mg·kg-1)，每日2次，连续8周，可增加高脂饮食脂联素基因敲除大鼠血FGF21的水平，改善胰岛素抵抗。利拉鲁肽可诱导KKAy小鼠肝脏FGF21生成，改善肥胖和高血糖，并增加GLP-1活性[5]。近期研究表明，利拉鲁肽通过激活脂肪组织中的固有天然杀伤T细胞(iNKT)，诱导其FGF21的表达来调节体重和血糖[6]。但是，利拉鲁肽对肥胖T2DM白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)中FGF21水平及AMPK、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径的影响目前尚未见相关报道。本研究先建立肥胖T2DM大鼠模型，再予以利拉鲁肽干预，观察其对附睾脂肪组织细胞的形态学和FGF21表达、AMPK和MAPK信号通路的影响，以阐述其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物40只8周龄SD大鼠，♂，体质量(170±20)g，购自安徽医科大学实验动物中心，每笼5只，温度(20~25)℃，相对湿度35%~60%，自由摄食和进水，适应性饲养1周。
1.1.2 药物与试剂利拉鲁肽(诺和力)购自诺和诺德中国制药有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma-Aldrich公司；RNAiso Reagent、逆转录试剂盒、Premix TaqTM购自大连宝生物工程有限公司；所有引物均采用Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA裂解液购自南京凯基生物科技有限公司；肝激酶B1(liver kinase B1, LKB1)、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、p-ACC兔多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p-ERK、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p-JNK、p38、p-p38抗体购自美国Bioworld公司；FGFR3和p-FGFR3抗体购自美国Affinity公司；过氧化物体增殖剂活化受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)抗体购自美国Abcam公司；β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强化学发光底物检测试剂盒(ECL发光剂)购自美国Thermofisher公司。
1.1.3 仪器Olympus AU640全自动生化分析仪；日本Nikon 80i荧光正置显微镜；英国Teche PCR仪；北京六一仪器厂电泳仪、电转仪；Gel Documentation system曝光系统和Chemi Scope series凝胶成像系统均购自Clinx科学仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 动物分组适应性饲养1周后，将SD大鼠随机分为正常饮食组(CON，n=8)和高脂饮食组(HFD，n=32)，CON组给予标准饲料，HFD组给予高脂饮食，8周后，HFD组大鼠给予小剂量STZ(30 mg·kg-1)一次性腹腔注射，建立肥胖T2DM大鼠模型(体质量超过基础饲料组平均体质量20%，取尾静脉血，测空腹血糖>7.8 mmol·L-1，即为造模成功)，再随机分为2组：假干预组(DM，腹腔注射生理盐水)和利拉鲁肽干预组(DM+LRG，腹腔注射利拉鲁肽0.4 mg·kg-1·d-1，每天2次)，干预6周。所有操作均遵守安徽医科大学实验动物伦理委员会要求。
1.2.2 血清代谢指标和FGF21测定所有大鼠禁食12 h后水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清(3 000 r·min-1，15 min)，分析血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)，ELISA法测定血清FGF21水平。
1.2.3 病理形态学观察取附睾脂肪组织，以10%的中性多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行常规HE染色，在光镜下观察并拍照。
1.2.4 免疫组化分析石蜡包埋脂肪组织以4 μm连续切片，SABC法进行PPARγ、p-AMPK、p-ACC、p-ERK的免疫组化分析，DAB显色，苏木精复染细胞核，使用PBS缓冲液代替一抗作为空白对照，光镜下观察并拍照。每张切片随机选取10个视野，用生物图像软件计算各组免疫阳性细胞的平均光密度值(integral optical density, IOD)。
1.2.5 RT-PCRRNAiso Reagent提取各组大鼠附睾脂肪组织总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR分析FGF21、FGFR3、LKB1、AMPK、ACC的mRNA表达，GAPDH作为内参照，应用Gel Documentation System曝光系统对目的基因和参照基因条带进行定量分析。检测的目的基因及引物序列见Tab 1。
| Gene | Reference Sequence | Primers(5′-3′) | Product Length/bp |
| FGF21 | NM_130752.1 | Forward: GCCTCTAGGTTTCTTTGCC | 243 |
| Reverse: GACTCCTGGTTGCTCTTGG | |||
| FGFR3 | XM_006251396.3 | Forward: TTCTGGCTCCCTCACTCC | 186 |
| Reverse: TGTCGAGCTATGACTCACCC | |||
| LKB1 | XM_006222372.3 | Forward: CCCCAGAAGCACTTTATGCC | 138 |
| Reverse:TGTGGTTGGTCGTGTTGTC | |||
| AMPK | NM_019142.2 | Forward: CAACAAGCCCACCCGATTC | 289 |
| Reverse:GGGTTCTTCCTTCGCACA | |||
| ACC | NM_022193.1 | Forward:AACCAGCACTCCCGATTC | 175 |
| Reverse:AGGCCAAACCATCCTGTAA | |||
| GAPDH | AC_000073.1 | Forward: GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG | 143 |
| Reverse: ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA |
取0.1 g附睾脂肪组织，RIPA裂解液制备匀浆，12 000 r·min-1、4℃离心15 min取上清抽提总蛋白并定量。以β-actin为内参照，Western blot法检测FGF21、β-klotho、p-FGFR3、FGFR3、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK的蛋白表达，Chemi Scope series凝胶成像系统分析结果。
1.3 统计学分析所有实验数据以x±s表示，SPSS 16.0统计软件进行数据分析，组间比较采用方差分析。
2 结果 2.1 利拉鲁肽对DM大鼠体质量的影响与CON组相比，DM组体质量明显上升，与DM组相比，DM+LRG组的体质量明显下降，表明利拉鲁肽有降低DM大鼠体质量的作用，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of liraglutide on body mass of obese DM rats (x±s, n=8) CON: Control diet group; DM: Type 2 diabetic mellitus group; DM+LRG: DM and liraglutide treatment group (0.4 mg·kg-1·d-1) |
与CON组比较，DM组大鼠TC、TG、ALT、AST均明显升高，DM+LRG组TC、TG与DM组相比差异无统计学意义，ALT、AST水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，HDL-C明显升高(P < 0.01)，见Tab 2。与DM组相比，DM+LRG组血清FGF21水平明显升高(Fig 2)。
| Group | TC/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 | HDL-C/mmol·L-1 | ALT/mmol·L-1 | AST/mmol·L-1 |
| CON | 1±0.36 | 0.39±0.14 | 1.08±0.21 | 46.25±20.85 | 92.75±26.91 |
| DM | 1.49±0.4# | 0.76±0.78# | 1.09±0.25 | 93.33±36.12# | 101±23.98## |
| DM+LRG | 1.501±0.03 | 0.56±0.23 | 1.38±0.12** | 70.95±15.88* | 70.95±12.73** |
| CON: control diet group; DM: type 2 diabetic mellitus group; DM+LRG: DM and liraglutide treatment (0.4 mg·kg-1·d-1). #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CON; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DM | |||||
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| Fig 2 Effect of liraglutide on serum FGF21 levels of obese DM rats(x±s, n=8) ##P < 0.01 vs CON; **P < 0.01 vs DM |
与CON组相比，DM组大鼠的WAT中脂肪细胞的体积明显增大(P < 0.01)；与DM组相比，DM+LRG组的WAT中脂肪细胞明显变小(P < 0.01)。对脂肪细胞大小进行测量的结果与上述描述一致，见Fig 3。
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| Fig 3 Representative photomicrographs of adipose tissues stained with haematoxylin and eosin(×200)(x±s, n=8) A: Control diet group; B: Type 2 diabetic mellitus group; C: DM and liraglutide treatment (0.4 mg·kg-1·d-1); D: Quantification of adipocyte size. ##P < 0.01 vs Control; **P < 0.01 vs DM |
与CON组相比，DM组大鼠WAT中FGF21、FGFR3、AMPK、ACC基因的mRNA表达较CON组增高，LKB1基因表达下降，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。与DM组相比，DM+LRG组WAT中FGF21、FGFR3的mRNA表达继续上升，而LKB1、AMPK、ACC的mRNA表达下降，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)，见Fig 4。
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| Fig 4 Effect of liraglutide on mRNA expression in adipose tissue of obese DM rats(x±s, n=8) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CON; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DM |
Fig 5免疫组化的结果显示，与CON组相比，DM组大鼠的WAT中PPARγ、p-AMPK、p-ACC的蛋白表达水平均明显降低，p-ERK蛋白表达水平明显升高，且主要分布在胞质中；DM+LRG组大鼠WAT中PPARγ、p-AMPK、p-ACC的蛋白表达均明显增加，p-ERK表达水平明显下降(P < 0.05或P < 0.01)。Western blot的结果显示，与CON组相比，DM组大鼠WAT中FGF21、β-klotho、p-FGFR3蛋白表达均减少(P < 0.05)；与DM组相比，DM+LRG组白色脂肪组织中FGF21、β-klotho、p-FGFR3蛋白表达均升高(P < 0.05)(Fig 6A、6B)。在AMPK信号通路中上游p-LKB1、下游p-ACC均与p-AMPK的变化趋势一致，表明该信号通路在DM状态时下调，利拉鲁肽治疗后上调(Fig 6C、6D)。本研究还分析了MAPK 3条信号通路分子的磷酸化改变，结果发现它们均表现为先升后降的趋势，即在DM时ERK、JNK、p38磷酸化增加，利拉鲁肽治疗后磷酸化水平减少(Fig 6E、6F)。
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| Fig 5 Effect of liraglutide on protein expression in adipose tissue of obese DM rats(immunohistochemistry, ×200)(x±s, n=8) #P < 0.05 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DM |
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| Fig 6 Effect of liraglutide on protein expression in adipose tissue of obese DM rats (x±s, n=8) A: Western blot of FGF21, β-klotho, p-FGFR3; B: Semi-quantitative analysis of protein expression of FGF21, β-klotho, p-FGFR3; C: Western blot of p-LKB1, p-AMPK, p-ACC; D: Semi-quantitative analysis of protein expression of p-LKB1, p-AMPK, p-ACC; E: Western blot of p-ERK, p-JNK, p-p38; F: Semi-quantitative analysis of protein expression of p-ERK, p-JNK, p-p38. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs CON; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DM. |
传统降糖药物的治疗过程中可能会出现体重增加、胰岛功能减退及慢性并发症等。LEAD(Liraglutide Effect and Action in Diabetes)研究表明，利拉鲁肽可有效降低血糖、血压、减轻体重，减少低血糖发生率。本研究结果表明，利拉鲁肽能明显降低T2DM大鼠的血脂水平和体重，其机制可能与诱导脂肪组织中FGF21 mRNA和蛋白水平的表达，进而激活AMPK和抑制MAPK通路有关，目前尚未见相关报道。
本实验显示，DM组大鼠的血脂和体重明显增加，HDL-C明显降低，DM+LRG组血脂和体质量明显下降，表明利拉鲁肽具有较好的改善高脂血症和降低体质量的作用。利拉鲁肽也能降低血清ALT、AST的水平，表明其还有一定的肝脏保护作用。
PPARγ可诱导WAT中FGF21的基因转录[7]。本研究证实，DM+LRG组WAT中PPARγ的表达升高，对应的血清FGF21水平与WAT中FGF21表达升高，表明利拉鲁肽可能通过PPARγ诱导FGF21的表达，并成为血清FGF21的重要来源之一。
饮食诱导的肥胖小鼠静脉连续输注FGF21，能够明显降低体重和血糖的水平, 同时还会引起肝脂肪变性逆转和血甘油三酯含量降低[8]。β-Klotho在WAT中含量丰富[2]，其选择性表达决定了FGF21生物学功能的组织特异性[9]。由于过度表达和活化的FGFR3主要与成脂分化有关[10]，本研究中检测了FGFR3和p-FGFR3，DM+LRG组WAT的β-Klotho、p-FGFR3表达均增加，可介导AMPK信号通路的激活。
AMPK是一种重要的细胞能量调节器，其上游激酶主要有LKB1和CaMKK[11]，其中LKB1广泛分布于人体多种组织中；下游靶分子ACC的磷酸化水平可作为机体内AMPK活化状态的标志物。本研究中DM+LRG组WAT中LKB1、AMPK、ACC磷酸化均增加，抑制脂肪酸及脂肪的合成，减少脂质沉积。RT-PCR和Western blot的结果不完全一致，推测可能与基因表达的转录后修饰有关。利拉鲁肽可增加大鼠血管内皮细胞中的AMPK磷酸化，减少JNK的磷酸化[12]，与本研究结果一致。
MAPK途径主要由ERK1/2、JNK、p38三条信号通路组成，在调控细胞增殖、分化和基因表达中有重要的作用。既往研究表明，利拉鲁肽可通过上调ERK1/2的磷酸化、下调JNK和p38的磷酸化，减少缺血诱导的细胞凋亡，以发挥其神经保护作用[13]。利拉鲁肽还能通过活化GLP-1受体、抑制ERK1/2，减少高糖诱导的血管平滑肌细胞的迁移、增殖和凋亡[14]。李婷婷等[15]报道，重组人FGF21作用于药物诱导胰岛素抵抗的HL-7702细胞时，可促进ERK1/2的磷酸化。本研究结果显示，利拉鲁肽通过诱导WAT中FGF21的表达、抑制MAPK 3条信号通路分子的磷酸化和活化，抑制脂肪细胞的增殖，推测可能与细胞类型和给药方式的不同有关。
本研究从组织水平上阐明利拉鲁肽诱导白色脂肪组织中FGF21的表达可能与激活AMPK和抑制MAPK信号通路有关，为深入了解利拉鲁肽作为肥胖和T2DM的首选药物、改善糖脂代谢提供理论依据。
( 致谢: 本实验在安徽医科大学基础医学院药理学教研室、生物化学与分子生物学教研室和综合实验室完成，感谢实验室老师和同学们给予的帮助和指导！)
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中国科协主管,中国药理学会主办
文章信息
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文章历史
- 收稿日期: 2018-02-04
- 修回日期: 2018-03-20
- 网络出版时间: 2018-05-24 11:19