2. 山西医科大学 第一医院内分泌科，山西 太原 030001
2. Dept of Endocrinology, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
糖尿病是多种病因引起的以慢性、渐进性血糖升高为主要特征的代谢性、内分泌疾病。除了血糖升高，糖尿病引起各种营养物质的代谢紊乱，随着疾病发展引起全身慢性并发症[1]。各种治疗糖尿病的方法与药物层出不穷，但截止目前糖尿病依然不可治愈，如何更好地治疗依然是科研界与临床的难题。
黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，是我国的传统中药。黄芩素(baicalein)是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一，也是发挥药效的主要活性成分[2]，可以特异性抑制12-脂氧合酶[3]。黄芩素具有抗炎[4]、抗病毒、抗肿瘤[5]、护肝[6]、清除自由基、保护神经等广泛作用。近年来，随着国内外学者对黄芩素研究的逐渐深入，已经证实黄芩素通过清除自由基和抗氧化[7]、降低血压及血脂、抑制蛋白激酶C的激活、抑制α-葡萄糖苷酶活性[8]、调节炎症细胞因子[9]、保护β细胞功能[10]等，发挥降低血糖及抗糖尿病作用，但关于离子通道的研究甚少。本研究旨在通过胰岛素分泌实验、钙成像技术、膜片钳技术，探讨黄芩素促进大鼠胰岛素分泌的离子通道机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物Wistar大鼠，♂，体质量180~250 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK-(军)2012-0004。
1.1.2 试剂黄芩素(批号:491-67-8)、Histopaque 1077(批号:RNBF1783)，均购自美国Sigma公司；胶原酶P(瑞士Roche, 批号:11104222); RPMI 1640培养基(批号: C518FA0002)、胎牛血清(批号:B326FA0092)，均购自上海生工；D-葡萄糖(批号:405A0918)、BSA(批号:83100513)均购自北京索莱宝；Dispase Ⅱ (美国Amresco, 批号:10888700);胰岛素检测试剂盒(北京北方生物技术研究所, 批号:20160320)。
1.1.3 仪器体式显微镜(上海中恒, 型号:SM262);细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技, 型号:HF100);倒置显微镜(日本Olympus, 型号:AE-2000);台式离心机(长沙湘仪, 型号:SC-3610);MODEL电极拉制仪(日本Narishige, 型号PP-830);MIRO FORGE抛光仪(日本Narishige, 型号:MF-200);EPC10全自动膜片钳(德国HEKA, 型号:MP-285);钙成像(北京MDE, 型号:LAMBDA 10-B)。
1.2 方法 1.2.1 获取Wistar大鼠的胰岛及胰岛β细胞快速处死大鼠，无菌条件下剖开腹腔，从胆总管逆行注入1 g·L-1胶原酶，完整剥取大鼠的胰腺组织，38℃水浴消化11 min，加入Histopaque 1077分离液梯度离心后，体式显微镜下手工挑取边缘整齐、透光率小，直径大小在100~300 μm的单个胰岛，并将其放入37℃、5% CO2的孵箱中培育[11]。用3 g·L-1的Dispase Ⅱ溶液消化培育状态好的大鼠胰岛，孵箱内消化5 min后，取出加入RPMI 1640培养基(含胎牛血清)，离心2 min后弃去上清液，将沉淀混匀后，滴在用细胞黏附剂处理过的5 mm×5 mm玻片上, 将玻片置于RPMI 1640培养基(含胎牛血清)中，放入37℃、5% CO2的孵箱中培育。
1.2.2 胰岛素分泌实验实验分为5组, 分别为2.8 mmol·L-1葡萄糖(低糖)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(高糖)、16.7 mmol·L-1葡萄糖+20 μmol·L-1黄芩素、16.7 mmol·L-1葡萄糖+50 μmol·L-1黄芩素、16.7 mmol·L-1葡萄糖+100 μmol·L-1黄芩素，每组7个EP管，35个EP管内各加入含2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH孵育液800 μL，每个EP管内挑取5个胰岛，于37℃、5% CO2的孵箱中孵育30 min。KRBH孵育液各成分浓度(mmol·L-1)：128.8 NaCl、4.8 KCl、1.2 KH2PO4、1.2 MgSO4、2.5 CaCl2·2H2O、10 HEPES、5 NaHCO3，pH 7.4。每100 mL KRBH中加入2 g BSA。30 min后取出所有EP管，弃去上清液，每组分别加入500 μL的2.8 mmol·L-1葡萄糖、16.7 mmol·L-1葡萄糖及含不同浓度黄芩素(20、50、100 μmol·L-1)的高糖KRBH，继续于孵箱中孵育30 min后取出，取上清液，用放免法检测胰岛素含量。
1.2.3 钙成像实验将细胞置于含2 μmol·L-1 Fura-2AM(Ca2+荧光探针，也称染液)和2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH孵育液中，37℃、5% CO2孵箱中避光孵育30 min后取出，用含2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRBH洗去染液, 将载有细胞的玻片置于激光共聚焦显微镜上，用8通道给药系统持续分别给予16.7 mmol·L-1葡萄糖、含50 μmol·L-1黄芩素的高糖KRBH及60 mmol·L-1KCl。设定激发光340 nm和380 nnm, 发射光510 nm，得到F340/F380，此比值反映细胞内Ca2+浓度变化。
1.2.4 膜片钳实验配制电极内、外液。电极外液各成分浓度(mmol·L-1)：138 NaCl、5.6 KCl、1.2 MgCl2·6H2O、2.6 CaCl2、5 HEPES，pH 7.4。电极内液各成分浓度(mmol·L-1)：140 KCl、1 MgCl2·6H2O、0.05 EGTA、10 NaCl、10 HEPES、0.3 Mg-ATP，pH 7.4。PP-830电极拉制仪拉制玻璃电极，充灌电极内液后电阻大小为4~7 MΩ, 将孵育好的细胞浸在含11.1 mmol·L-1葡萄糖及含11.1 mmol·L-1葡萄糖和不同药物浓度的电极外液中。选取细胞膜电容>7PF的细胞(视为β细胞[12])，电极尖端与细胞膜片之间形成高阻封接(电阻≥GΩ)后，将电压钳制在-70 mV, 给予-70~80 mV的电压刺激400 ms, 负压破膜，全细胞记录模式下记录Kv电流。
1.2.5 统计学处理实验数据用x±s表示。胰岛素分泌数据用Sigmaplot 12.0软件分析, 两组之间用t检验，多组之间用方差分析。膜片钳数据、钙成像数据用Pulsefit软件、Sigmaplot12.0软件、Igor软件处理。
2 结果 2.1 黄芩素对大鼠胰岛素分泌的影响实验分组如下：2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8G)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7G)作为对照、在16.7G前提下加入不同浓度的黄芩素。如Fig 1所示，20、50 μmol·L-1黄芩素呈浓度梯度性促进胰岛素分泌，100 μmol·L-1的黄芩素没有进一步促进分泌。实验表明，黄芩素可以促进胰岛素的分泌，其体外促进大鼠胰岛素分泌的最佳药物浓度是50 μmol·L-1。
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| Fig 1 Effects of baicalein on insulin secretion of rat islets(n=7) Rat islets were incubated in KRB buffer with 2.8 mmol·L-1 glucose or 16.7 mmol·L-1 glucose or different concentrations of baicalein for 30 min. Insulin secreted into supernatant was measured by ELISA. **P < 0.01 vs 2.8G; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 16.7G. |
选取最佳促进胰岛素分泌浓度，分别用16.7 mmol·L-1葡萄糖、50 μmol·L-1黄芩素、60 mmol·L-1氯化钾干预胰岛β细胞，F340/F380反映细胞内[Ca2+]i。Fig 2结果表明，50 μmol·L-1黄芩素干预细胞后，细胞内[Ca2+]i较16.7 mmol·L-1葡萄糖干预时升高，差异且具有统计学意义(P < 0.01)。结果表明，黄芩素可以提高细胞内[Ca2+]i。
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| Fig 2 Effect of baicalein on intracellular [Ca2+]i levels(n=6) A: The radio of F340/F380 reflected intracellular [Ca2+]i levels. β-cells were treated with 16.7 mmol·L-1 glucose or 50 μmol·L-1 baicalein or 60 mmol·L-1 KCl intervention, 60 mmol·L-1 KCl intervention was treated as positive control; B: Bar graph using the mean of the radio of ΔF340/F380. **P < 0.01 vs 16.7G. |
分别用含11.1 mmol·L-1葡萄糖的电极外液及不同药物浓度的电极外液干预细胞，含11.1 mmol·L-1葡萄糖的电极外液干预的细胞作为对照组，分别经过高阻封接、钳制电压、破膜后，全细胞模式下记录Kv电流。Fig 3结果表明，与对照组相比，20 μmol·L-1黄芩素抑制了Kv电流，50 μmol·L-1黄芩素进一步抑制β细胞Kv。实验表明，黄芩素可以浓度梯度性抑制β细胞Kv电流。
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| Fig 3 Effects of baicalein on Kv channels(n=6) A: Representative Kv current traces under different concentrations of baicalein; B: Current-voltage relationship curves of different concentrations of baicalein on Kv channels from rat β cells; C: Bar graph using summary of the mean current density of Kv channels recorder at 80mV depolarization. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
糖尿病的主要特征是胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素发挥作用障碍[1]，因此，促进胰岛β细胞分泌功能、改善胰岛素抵抗可以有效治疗糖尿病。黄芩素是从传统中药黄芩的干燥根里提取的黄酮类化合物，近年来由于其广泛的药理学作用而受到大量关注。国内外研究证实，黄芩素具有抗糖尿病及改善糖尿病并发症预后的作用。黄芩素可以通过减轻INS-1细胞炎症损伤促进胰岛素分泌[7]，通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路改善糖尿病大鼠相关的认知障碍，通过减轻新陈代谢紊乱[13]治疗糖尿病等，但黄芩素抗糖尿病的离子通道机制尚不清楚。
现有的研究证实，胰岛素是人体内唯一可以降低血糖的激素，由胰岛β细胞分泌。胰岛β细胞是可兴奋细胞，刺激后分泌的胰岛素与其细胞膜上离子通道的活动密切相关。胰岛β细胞上主要的离子通道包括ATP敏感性钾通道(KATP)、电压依赖性钾通道(Kv)和电压门控性钙通道(voltage-gated calcium channel，VDCC)。葡萄糖是刺激胰岛素分泌的主要因素，其进入细胞经过糖酵解和氧化磷酸化生成ATP，细胞内ATP/ADP比例升高使KATP通道关闭，细胞动作电位去极化。当动作电位去极化到一定程度时，电压门控性钙通道开放，细胞外Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度升高，促发胰岛素囊泡的运动、与细胞膜融合释放胰岛素。当细胞膜电位去极化到一定程度后，Kv开放, 细胞内K+外流，细胞动作电位复极化，分泌活动停止[14]。
在本研究中，关于胰岛素分泌功能的实验证实，高糖情况下，黄芩素呈浓度梯度依赖性的方式促进胰岛素分泌，其体外实验最佳药物浓度为50 μmol·L-1。β细胞分泌功能与细胞内钙离子浓度成正比[14]，我们通过钙成像实验得到细胞内Ca2+浓度变化，研究黄芩素促进分泌的作用与细胞内钙离子浓度的关系。本实验钙成像结果显示，用黄芩素50 μmol·L-1干预胰岛β细胞，细胞内Ca2+浓度上升，且差异具有统计学意义。因此推断，黄芩素促进分泌的作用是通过升高细胞内钙离子浓度产生的。参与β细胞分泌活动的离子通道Kv参与β细胞动作电位的复极化，抑制Kv通道可以减少细胞内K+外流，延长动作电位，使β细胞动作电位复极化过程减慢，从而延长分泌活动的时间，促进分泌。我们运用全细胞膜片钳技术研究不同浓度黄芩素(20、50 μmol·L-1)的促进分泌作用与Kv通道的关系。实验结果表明，黄芩素呈浓度梯度依赖性的方式抑制Kv电流。因此，黄芩素可以通过抑制Kv通道，延长动作电位促进分泌。
综上所述，本实验通过胰岛素分泌实验、钙成像技术、膜片钳技术，从不同的角度阐明了黄芩素可以促进大鼠胰岛素分泌功能，即通过抑制胰岛β细胞Kv通道，增加细胞内钙离子的浓度，从而进一步增加胰岛素的分泌。胰岛素分泌过程中KATP通道的关闭也是其中一个重要环节[14]，黄芩素是否对KATP通道和VDCC通道有作用，以及各离子通道之间的联系尚有待进一步的研究。
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