多年生草本姜黄素(curcumine, CM)是一种从姜黄根茎中提取的酚类活性物质，广泛种植于热带南亚和东南亚国家[1]。许多研究表明其毒性低，在抗肿瘤方面的潜力巨大[2]。CM对所有类型的肺癌细胞具有细胞毒性作用，如非小细胞肺癌A549和H1975细胞、大细胞肺癌H460细胞、肺鳞状细胞癌Calu-1细胞、小细胞肺癌H446和H187[3]。然而，水溶性差和快速降解引起生物利用度低，因此，提高CM的生物利用度对临床应用具有重要意义[4]。脂质体是由磷脂双分子层形成的、内部包含药物的封闭囊泡，具有缓释、靶向性、组织相容等优点。壳聚糖为天然高分子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和黏附性[5-6]，可用于脂质体的包衣，以增加脂质体的稳定性和靶向性。近年来，壳聚糖在医药领域中的应用不仅包括止血、抗菌、人造组织器官等研究，还被广泛用作药物载体材料[7-8]。本文初步考察了壳聚糖包衣姜黄素脂质体(chitosan coated curcumin liposomes, CMLP-CS)的体外释药特征及大鼠体内的药代动力学行为，以期促进CM吸收，提高其生物利用度，并为进一步研究CMLP-CS口服给药奠定基础。
1 材料 1.1 药物与试剂CM(规格：10 mg，西安帅诺生物科技有限公司)；蛋黄卵磷脂(规格：500 mg，国药集团化学试剂有限公司)；胆固醇(规格：500 mg，国药集团化学试剂有限公司)；尼群地平(纯度＞99%，国药集团化学试剂有限公司)；壳聚糖(脱乙酰度95%，规格1 g，浙江金壳生物化学有限公司)；乙腈、乙醇等均为色谱纯，实验用水均为超纯水。
1.2 仪器LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；T-6新世纪紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Nano-ZS90型马尔文粒径测定仪(英国马尔文公司)。
1.3 实验动物12只SD健康大鼠，♂，体质量(230±20)g，动物使用许可证号：SYXK(渝)2015-0001，重庆医科大学动物实验中心提供。
2 方法 2.1 CMLP-CS的制备采用薄膜分散法制备姜黄素脂质体[9]。称取处方量的磷脂、胆固醇和姜黄素于梨形瓶中，用无水乙醇超声溶解后，旋转蒸发挥去乙醇，在瓶壁形成均匀类脂薄膜。再加入适量磷酸盐缓冲液(pH 6.8 PBS)，45℃旋转水合60 min使膜溶解，探头超声5 min，即得姜黄素脂质体。将得到的上述脂质体初悬液10 mL，缓慢滴加到一定体积的2 g·L-1 CS溶液中，再继续搅拌120 min(700 r·min-1)，冷却至室温，4℃冰箱静置保存。
2.2 体外释放动力学动态透析法考察CMLP-CS和CM的体外释药特点。将同浓度的CMLP-CS和CM各1 mL分别投进预先处理好的透析袋，将透析袋分别投入两种释放介质(pH 1.2 HCl；pH 6.8 PBS)中，平行操作3份，于水浴恒温震荡(37℃，100 r·min-1)，分别于不同时间点取出1 mL释放介质，同时补充等温等体积的释放介质[10]。测定取出的释放介质中CM的紫外吸光度，计算CM浓度，绘制释放曲线，并采用相似因子法对释放曲线进行评价。
2.3 大鼠体内药代动力学 2.3.1 给药方案与样品采集将♂ SD大鼠禁食12 h，自由饮水，随机分为2组，分别灌胃给予CMLP-CS、CM(给药剂量均为45.0 mg·kg-1)，给药后于不同时间点大鼠眼眶取血500 μL，6 000 r·min-1离心10 min(离心管已经过肝素预处理)，取上层血浆于-20℃冰箱保存。
2.3.2 血浆样品处理方法取200 μL待测血浆样品，加入80 μL尼群地平内标工作液(5 mg·L-1)，乙酸乙酯萃取2次，每次加入500 μL乙酸乙酯，涡旋震荡5 min后，12 000 r·min-1离心10 min，合并有机相后用氮气挥干，加入100 μL流动相复溶，吸取20 μL复溶液进样[12]。
2.3.3 样品测定方法的建立色谱柱为伊利特C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)；流动相为乙腈:5%冰乙酸溶液=55 :45(V/V)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为430 nm；柱温为30℃。称取CM 10 mg，乙醇溶解并定容至50 mL，得200 mg·L-1 CM储备液。取空白血浆200 μL，用CM储备液配制浓度分别为15、25、50、75、100、200、400 μg·L-1的CM系列血浆溶液，各取20 μL进样记录峰面积[12]。以CM和内标的峰面积之比为纵坐标Ss/Si，以CM浓度为横坐标c，做线性回归，并计算其回归方程。
2.3.4 方法学考察取空白血浆，制备高、中、低(400、200、50 μg·L-1)3个浓度的CM血浆样品，考察精密度，萃取回收率和方法回收率[12]。
2.3.5 数据分析通过DAS 2.1.1软件计算和分析数据，对CMLP-CS和CM的AUC(0~72h)及cmax等主要药动学参数进行方差分析，进行90%可信限考察，Tmax采用非参数统计Wilcoxon检验，评价CMLP-CS和游离CM是否具有生物等效性(α=0.05)。
3 结果 3.1 体外测定方法经考察，制备的CMLP-CS的平均粒径约为550 nm，平均Zeta电位为23 mV，包封率约为78%。体外标准曲线方程为Y=0.1468X-0.0094，R=0.9999。CM溶液的浓度在0.5~8 mg·L-1范围内线性良好。日内精密度RSD分别为2.58%、2.03%、1.93%，日间精密度RSD分别为2.67%、3.44%、2.91%，均符合方法学要求。
3.2 体外释放动力学 3.2.1 体外释放曲线CMLP-CS和CM在两种释放介质中的体外释放曲线，见Fig 1。CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中，48 h内为快速释放期，累积释放率分别为(64.99±0.65)%和(63.34±1.23)%，48 h后缓慢并持续释放。在148 h时，CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中的累积释放率分别为(70.48±0.50)%和(72.35±1.04)%，分别是游离CM的1.8倍和2.6倍。结果表明，CMLP-CS明显提高了体外释放率，可改善体外释药行为。
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| Fig 1 Drug release curve of CMLP-CS and CM in pH 6.8 PBS(A) and pH 1.2 HCl(B) |
采用相似因子法[14]评价溶出曲线，经计算得到的相似因子见Tab 1。CMLP-CS与CM分别在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子小于50，提示释放行为不相似，两者之间没有明显差异。此外，CM在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，CMLP-CS在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，提示它们在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中释放行为相似，而且两者之间没有差异，上述结果与Fig 1描述一致。
| Formulation 1 and dissolution media | Formulation 2 and dissolution media | Similarity factor |
| CM, pH 1.2 HCl | CMLP-CS, pH 1.2 HCl | 35.69 |
| CM, pH 6.8 PBS | CMLP-CS, pH 6.8 PBS | 33.23 |
| CM, pH 1.2 HCl | CM, pH 6.8 PBS | 88.29 |
| CMLP-CS, pH 1.2 HCl | CMLP-CS, pH 6.8 PBS | 89.87 |
对浓度c与S(Ss/Si，待测血浆样品和内标物的峰面积之比)进行线性回归，得回归方程为：S=0.010 5c+0.123 3，r=0.9970，CM在15~400 μg·L-1浓度范围内线性良好，最低检测限(S/N=3)为5 μg·L-1。该方法在CM低、中、高3个浓度的日内精密度RSD和日间精密度RSD均小于5%，均符合生物样品分析要求[12]，其萃取回收率和方法学回收率符合含量测定方法要求。
3.3.2 药动学参数CMLP-CS和游离CM的平均血药浓度-时间曲线，见Fig 2。经DAS 2.1.1软件计算分析，主要药动学参数见Tab 2。Fig 2显示，CM和CMLP-CS分别在0.25 h和3 h时达到了最大血药浓度，可知CMLP-CS的达峰时间Tmax是CM的12倍，CMLP-CS的cmax值也明显大于CM，说明与CM相比，CMLP-CS具有更长的释放时间，表现出缓释作用。CMLP-CS的曲线下面积AUC远远大于CM，表明CMLP-CS其在体内的吸收效果明显优于CM，口服生物利用度更好。由Tab 2计算可知，CMLP-CS的AUC(0~72h)值约为CM的8.9倍，CMLP-CS的相对生物利用度为846.5%，CMLP-CS明显提高了CM的体内口服生物利用度。CMET的MRT(0~72h)大于CM，其值为CM的3.7倍，说明CMLP-CS能够克服CM在体内被迅速消除的缺点，延长在体内的作用时间，从而利于提高生物利用度。
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| Fig 2 Mean concentration-time curves of CMLP-CS and free CM with oral administration (n=6) |
| Main parameter | CMLP-CS | CM |
| AUC(0~72 h)/μg·L-1·h-1 | 606.20±93.58 | 67.76±22.12 |
| MRT(0~72 h)/h | 8.23±04.62 | 2.24±0.28 |
| Cmax/μg·L-1 | 108.71±4.46 | 70.27±11.67 |
| Tmax/h | 3.00±0.00 | 0.25±0.00 |
| VRT(0~72 h)/h2 | 98.87±36.10 | 5.41±1.87 |
| T1/2/h | 7.44±1.03 | 2.55±0.25 |
由Tab 3可知，CMLP-CS与游离CM的AUC(0~72 h)、AUC(0~∞)两个参数的90%可置信区间均不在生物等效性标准区间范围内，因此CMLP-CS与游离CM生物等效性不合格。另外，对达峰时间Tmax进行非参数统计Wilcoxon检验，结果显示，CMLP-CS和CM的达峰时间Tmax差异具有显著性(P < 0.05)。按照生物等效性的判定标准，CMLP-CS与CM生物不等效，CMLP-CS的药效学标准高于CM。
| Parameter | 90% confidence interval | Bioequivalence standard | Bioequivalence |
| AUC(0~72h) | 151.9%~171.1% | 80%~125% | No |
| AUC(0~∞) | 147.1% ~168.5% | 80%~125% | No |
| Cmax | 105.3% ~115.7% | 70%~143% | Yes |
| Total | - | - | No |
姜黄素是一类溶解性低、渗透性高的药物，其口服生物利用度低。本文采用经典的薄膜分散法制备CM纳米脂质体，可改善药物的溶解性，并在脂质体的表面包覆有天然多糖壳聚糖，其生物相容性好、黏附性强，能够打开胃肠道上皮细胞的膜孔，促进大分子穿过上皮组织的转运，并通过黏附作用延长脂质体在体内的滞留时间，从而提高生物利用度。
本文将CM制备成CMLP-CS后，在相同的释放介质中，48 h以前CMLP-CS的释放速率略快于CM，其原因可能是少部分未包封的CM与两亲性的磷脂结合快速释放，而48 h后，游离的CM的累积释放率已达到最高，药物释放已接近饱和，而CMLP-CS仍然持续释放药物至148 h，具有良好的缓释效果。其原因可能是包载在亲水中心的CM不仅需要穿过磷脂双分子层，还需要穿过脂质体表面的壳聚糖包衣从而进行释放，双重“屏障”可能是其缓释作用的主要原因。
在体内药代动力学研究中，CMLP-CS和CM的药时曲线均出现了双峰。CM的药时曲线出现双峰现象可能是由于CM经口服后在体内快速向组织分布，其中一部分在肝脾等器官中蓄积后再次释放入血。而CMLP-CS的药时曲线出现双峰的原因可能如下：(1)未包封的CM快速入血，包封在脂质体内的CM由于需要穿过磷脂和壳聚糖双重屏障而达到持续释放入血，从而达到最大血药浓度；(2)具有生物黏附性的壳聚糖增加药物与胃肠道接触的面积与时间，从而延长了药物的释放时间。药时曲线和主要药代参数均表明，CMLP-CS可明显提高CM的在体内的口服生物利用度，其表现出的缓效长效作用与体外释放动力学考察的结果一致。综上所述，CMLP-CS可增加体外释药量，改善体外释放行为，明显提高姜黄素的口服生物利用度，具有良好的促进吸收作用，为进一步研究姜黄素口服纳米制剂提供了理论基础。
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