外泌体是一种直径约20~150 nm并具有脂质双分子层膜结构的囊性小泡。研究发现，大多数真核细胞均能分泌外泌体，广泛存在于多种体液中，如血液、脑脊髓液、尿液、唾液等。近来研究发现，外泌体参与调节神经发育、分化、再生以及神经元谷氨酸能突触的可塑性，且作为天然递送载体，可穿越血脑屏障靶向传递药物或核酸类物质，发挥治疗神经系统疾病的作用^[1]。大多中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病形成机制尚不明确，且治疗手段的相对匮乏，因而外泌体在CNS生理和病理学形成机制及其内含物RNAs分子功能学等方面，成为了目前科研及临床诊治研究的热点之一。

在CNS中，大多数的细胞包括神经干细胞/祖细胞、神经元细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等均可形成及分泌外泌体^[2]。首先，细胞膜内出芽形成早期内体(early endosomes，EEs)，EEs二次出芽形成管腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)。这些包含多泡体(multivesicular bodies，MVBs)的ILVs，在与细胞膜融合后，释放MVBs到细胞外基质中，形成外泌体^[3]。在ILVs形成过程中，内涵体分选复合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)通过依赖与非依赖途径，促进EEs内陷形成ILVs及运输内容物进入ILVs，最终形成包含内容物的外泌体^[4]。

外泌体含有多种短链RNAs和长链RNAs，其RNAs种类及含量随细胞状态变化而发生改变。根据2015年9月最新版Vesiclepedia数据库报道，已从33种外泌体中发现27 642种mRNAs和4 934种miRNAs(http://www.microvesicles.org/)。除此之外，外泌体中还发现含有病毒RNA、tRNA片段、小核RNA、核仁小RNA、piRNA、非编码RNAs (ncRNAs)等^[5]。这些外泌体所包含的RNAs被称为外泌体源性RNAs(exosomes shuttle RNAs，es-RNAs)。体外研究发现，外泌体源性mRNA(es-mRNA)转移至靶细胞后，通过翻译蛋白质发挥生物学功能，参与多种生物学进程如免疫反应、肿瘤、病毒感染等。外泌体源性miRNA(es-miRNA)转移至靶细胞后，则通过沉默靶基因发挥RNA干扰作用，在转录水平后调控基因表达^[6]。尽管已有研究报道es-RNAs可调节靶基因的表达，但是其中的分子机制仍未阐述清楚。以es-miRNAs为例，在动物细胞中，双链前体miRNA(miRNA precusor, pre-miRNA)经Dicer剪切后成为双链成熟miRNA/miRNA^*，并随即整合进入AGO2-RISC组装复合体(AGO2-RISC-loading complex，AGO2-RLC)，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，其后RISC与靶基因mRNA特异性结合后诱导基因沉默。然而，外泌体转运的单链成熟miRNAs如何与内源性AGO蛋白结合形成RISC，这一机制尚无报道。而miRNAs是以单链成熟、双链成熟miRNA/miRNA^*，还是RISC等形式存在外泌体中，目前也鲜有报道，这些问题仍需解答以说明外泌体是有效RNAs的载体。

细胞释放外泌体后，后者通过与细胞表面分子的直接作用、与细胞膜融合以及胞吞等方式，与邻近或远距离的受体细胞进行细胞间的信息传导，进而调节受体细胞的行为。与受体细胞接触后，外泌体的内容物或降解或释放进入细胞质，而进入胞质的内容物则进一步被运输到细胞核内或细胞膜上，进而发挥生物学功能^[7]。在此过程中，外泌体与受体细胞的相互识别是外泌体发挥作用的重要前提，但是目前有关两者相互识别的作用机制还知之甚少。Purushothaman等^[8]发现，内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素可作为外泌体的识别受体，而来自骨髓瘤细胞的外泌体，其表面的纤连蛋白与受体细胞的硫酸乙酰肝素结合，介导了外泌体-细胞相互作用。另有Edgar等^[9]报道，外泌体通过与细胞质膜表面tetherin蛋白结合而聚集在Hela细胞表面，而敲除tetherin后，与细胞质膜结合的外泌体数量下降了80%，并伴随游离外泌体数量的增加。这些研究表明，不同细胞来源的外泌体与靶细胞的识别机制可能不尽相同，这也可能是外泌体具有靶向性的原因之一。

在中枢神经系统中，感觉神经与运动神经元、中间神经元以及神经胶质细胞之间需要通过物质交流来发挥功能和维持细胞的完整性，而参与物质传递的外泌体则完善了CNS细胞间信号交流网络，在促进神经元存活、介导免疫反应、改变突触可塑性等方面发挥重要功能。2005年，Marzesco等^[10]首次报道，在大脑早期发育阶段发现外泌体，并在胚胎期小鼠的神经管腔内液中发现外泌体(50~80 nm)及其他胞外囊泡(600 nm)，两者均含有干细胞标志分子prominin-1(CD133)，提示神经干细胞可能通过胞外囊泡丢弃prominin-1，从而促进神经细胞的形成。随后，Lachenal等^[11]观察到体外培养的成熟大脑皮层及海马神经元亦能释放外泌体，且其释放受胞膜动作电位去极化和谷氨酸能突触活动的调节，表明外泌体可能参与CNS的正常生理活动。Feliciano等^[12]近年来在人类和啮齿类动物的胚胎脑脊液中发现外泌体，这些外泌体含有miR-124、125 b、17~5、92 b、93、92 a、181 a、99 b、Let-7等，与神经干细胞共孵育后，通过活化IGF-mTORC1信号通路，促进神经干细胞的增殖。Oh等^[13]通过微流体示踪法观察到外泌体的释放、转移和摄取的过程，发现外泌体携带的miR-193 a通过阻断增殖相关基因，促进受体细胞——神经干细胞分化发育成为神经元细胞。

CNS是一个庞大而复杂的网络系统，突触作为其中的传导结构在大脑功能中起着极其重要的作用。外泌体作为神经细胞相互之间交流的途径之一，不但参与调节神经细胞的形成与分化，还参与调控突触的可塑性，且可能是突触顺行与逆行信息传导的潜在机制。Goldie等^[14]发现，人源神经母细胞经K⁺诱导去极化处理后，树突部位释放富含miRNA的外泌体，经突触摄取后，外泌体miR-638、-149^*、-4281、let-7e靶向调控突触功能相关mRNA，涉及调控前突触、后突触的分布密度和神经元突触的功能与结构的可塑性。Morel等^[15]还发现，神经元细胞释放外泌体介导miR-124a的转移，促进星形胶质细胞上调谷氨酸转运体GLT1的表达，这可能是神经元-胶质细胞信息交流调控突触活性的新机制，可为研发治疗高表达GLT1所致疾病提供新思路。

外泌体携带疾病相关蛋白，如β-样淀粉蛋白、α-突触核蛋白、TDP-43等，造成“毒性”蛋白的散布，从而导致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森(Parkinson's disease, PD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等疾病的形成和传播^[16]。目前就外泌体方面，神经退行性疾病的发病机制大多集中在研究疾病相关蛋白。尽管先前有报道，神经退行性疾病病患血液及脑脊液中miRNA表达谱发生变化，但是研究大多在寻找简单可靠的检测指标来诊断神经退行性疾病，而就es-RNAs参与疾病的发展方面，相关研究还相对较少。目前，Sarkar等^[17]报道，AD患者及转基因AD小鼠相关脑区内高度表达miR-34a，神经元释放内含miR-34a的外泌体，被邻近神经元细胞摄取后，miR-34a靶向阻断SIRT1和ADAM10基因，导致β-样淀粉蛋白的形成与沉积，提示神经元之间通过外泌体转运疾病相关RNAs，以另一种方式引起AD“毒性”蛋白的散布，引发神经毒性反应，进而导致AD疾病的形成与发展。另有Hu等^[18]发现，吗啡可加重HIV病毒反式激活蛋白Tat介导的神经细胞毒性反应。体外实验发现，吗啡使HIV Tat感染的星形胶质细胞源性外泌体内miR-29b含量增加，神经元细胞摄取该外泌体后，胞内miR-29b含量增加，引起神经保护因子——血小板源生长因子PDGF-B表达水平的降低，从而使神经元细胞相对生存率下降，最终导致细胞凋亡，而干预外泌体的形成可逆转这一过程，提示es-RNAs可通过介导细胞损伤，促进神经损伤性疾病的形成。

肿瘤微环境对肿瘤的形成与发展具有重要作用，而外泌体转运的RNAs常常能改变肿瘤微环境，进而诱导增殖与转移。恶性胶质瘤是一种极难治愈的高度恶性脑内肿瘤，van der Vos等^[19]发现，恶性胶质瘤释放外泌体介导miR-451与miR-21转移至小胶质细胞及单核细胞/巨噬细胞中，从而下调c-Myc mRNA的表达并释放免疫抑制因子，保护肿瘤不受免疫攻击。另外，Zhang等^[20]的研究显示，大脑转移性肿瘤细胞分泌因子使星型胶质细胞聚集并发生反应性胶质化，并促使后者分泌内含miR-19a的外泌体。肿瘤细胞摄取该外泌体后，引起胞内抑癌基因PTEN表达水平的降低，从而导致NF-κB依赖的趋化因子CCL2释放增加，CCL2随后招募IBA1⁺骨髓细胞刺激肿瘤细胞增殖，并抑制肿瘤细胞凋亡。这些研究表明，在脑部肿瘤发展与增殖过程中，es-RNAs可改变肿瘤微环境，进而维持肿瘤在体内的生存与发展。

研究发现，在多种中枢神经疾病中，患者脑组织与体液miRNAs表达谱发生明显变化。对比不易取得的脑部病理组织标本，外泌体较易获取，且能稳定存在于体液中，因而es-miRNAs作为潜在的诊断中枢神经疾病的标记分子，极大地吸引着研究者的兴趣。Riancho等^[21]报道，与正常对照相比，AD患者脑脊液中es-miRNAs表达谱发生较大变化，其中15个miRNAs的明显发生改变。50%与70%的正常对照样品中分别检测出miR-9-5p与miR-598，而所有的AD患者样品中均没有检测出来，提示miR-9-5p与miR-598可能是AD潜在的标记分子。而Cheng等^[22]报道，使用商用试剂盒提取血液外泌体后，对es-miRNAs表达谱进行分析，通过差异表达的es-miRNAs区分AD患者与正常对照，且该诊断体系的敏感度和特异度分别为87%和77%，提示该方法对AD有较好的诊断价值。

外泌体作为一种纳米级别的胞外囊泡，能穿透血管壁和血脑屏障，且内源性外泌体能躲避机体免疫反应，不良反应较少，因而具有成为基因治疗的新载体的潜力^[23]。Didiot等^[24]报道，外泌体可作为寡核苷酸运载体用于治疗亨廷顿疾病。胶质母细胞瘤(U87)与疏水修饰的hsiRNAs孵育后，分泌装载hsiRNAs的外泌体，该es-hsiRNAs可被小鼠原代皮层神经元摄取，从而促进亨廷顿疾病mRNA和蛋白的剂量依赖性沉默。而通过注射es-hsiRNAs到小鼠纹状体中，可致大脑两侧分布es-hsiRNAs，并促使两侧的亨廷顿病mRNA高达35%的明显沉默。另外，Liu等^[25]报道，293T细胞转染了狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)与阿片样物质受体siRNA(MOR siRNA)后，分泌装载MOR siRNA的外泌体(es-MOR siRNA)，且外泌体膜上表达RVG，能穿越血脑屏障，与神经元细胞发生特异性结合。外泌体转运MOR siRNA进入成神经瘤细胞，明显下调胞内MOR mRNA与蛋白水平。小鼠静脉注射es-MOR siRNA后，大脑皮层、海马、下丘脑和纹状体中均有分布MOR siRNA，明显下调脑内MOR mRNA与蛋白水平，且能明显减少吗啡诱导的条件位置性偏爱(conditioned place preference, CPP)时间，提示es-MOR siRNA可用于吗啡的复吸治疗。这些研究均显示，经修饰的外泌体装载某些治疗“药物”，传递到脑部后可实现广泛分布，进而发挥治疗作用，为多种中枢神经疾病提供新的治疗方向。

综上所述，外泌体源性RNAs，尤其是es-miRNAs在调节受体细胞的生理活动、神经元的分化发育、突触可塑性中发挥重要作用。尽管目前研究发现外泌体转移的miRNAs在转录水平后调控受体细胞的基因表达，并参与多种神经系统疾病的形成与发展。但是这些研究大多是在体外完成，包括体外培养细胞以及分离其外泌体，继而在体外或体内观察该培养细胞的外泌体对受体细胞的作用。那么在体内，如何通过监测及追踪某一体内细胞分泌的外泌体，进而观察它对受体细胞的影响，且其转移的RNAs的量是否能使受体细胞的表型发生“质的改变”，这些问题仍需进一步的探讨。另一方面，外泌体因包裹疾病标记分子，且能稳定存在于体液中，极大地推动了基于外泌体的疾病诊断试剂盒以及新型治疗工具的研究与发展。但是，CNS疾病相关细胞分泌的外泌体在脑脊液及血液中含量较低，且目前提取方法所得外泌体得率及纯度较低，使得以生物标记分子es-miRNAs为基础的疾病诊断研究重现性较差，仍需进一步验证。此外，外泌体作为一种新型的非细胞治疗方法，既可避免细胞治疗带来的安全隐患，又可包裹基因药物穿越血脑屏障，因而在治疗CNS疾病中有良好的应用前景。但是，目前主要提取外泌体的方法仍是传统的超速离心法，操作时长，步骤繁琐，因此，仍需要开发快速有效的分离方法，以获取大量且纯度较高的外泌体，以适应研究需求。