2. 四川省眉山市心脑血管病医院药剂科，四川 眉山 620020
2. Dept of Pharmacy, Meishan Cardiovascular and Cerebrovascular Hospital, Meishan Sichuan 620020, China
吴茱萸碱(evodiamine, EDM)主要是从传统中药吴茱萸的成熟果实中提取获得，具有抗癌、减肥、镇痛、抗炎等众多药理功效的一种吲哚喹啉类生物碱[1-2]。据相关研究报道显示，EDM具有广谱的抑癌活性，尤其用于小细胞肺癌的治疗[3-4]。但由于EDM的水溶性极差、生物利用度极低的缺点[5]，大大地限制了它在临床上的广泛应用。
大量研究证实，对前体药物进行结构修饰，是改善其理化性质的有效方法之一[6]。本文通过对EDM进行结构修饰，在N13位引入丁酰基，合成了水溶性更强的吴茱萸碱丁酰衍生物(evodiamine butyryl derivative, EBD)。本课题组前期体内外研究证实，EBD具有明显的抗肿瘤作用，但EBD对提高EDM的口服生物利用度有限。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是一种新型纳米递药系统，具有磷脂双分子层结构，能提高药物的口服生物利用度，降低毒副作用，尤其适用于难溶性抗肿瘤药物的靶向治疗[7]。所以，本研究对EDM进行结构修饰合成EBD(Fig 1)后，进一步制备了吴茱萸碱丁酰衍生物固体脂质纳米粒(evodiamine butyryl derivative-loaded solid lipid nanoparticles, EBDLN)，通过结合结构修饰和纳米制剂的优势，最大限度地提高EDM的生物利用度。本文研究了EBDLN的体外释放和在体胃肠吸收过程，有助于EDM在临床的广泛应用。
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| Fig 1 Chemical structural formulas of EDM and EBD |
SD大鼠，♂，体质量(250±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK渝2017-0001。
1.2 药品与试剂EDM(纯度＞99%，武汉远城科技发展有限公司)；单硬脂酸甘油酯(成都科龙化工试剂厂)；注射用大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司)；葡聚糖凝胶G-50型层析柱(中国医药上海化学试剂公司)，其余试剂为分析纯。
1.3 仪器Agilent1100液相色谱仪(美国Agilent公司)；RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣有限公司)；ZS90型激光粒度电位仪(英国马尔文公司)。
2 方法 2.1 EBD的制备采用一步合成法制备了EBD[8]。取适量EDM溶于15 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌溶解后，加入少量氢化钠并搅拌0.5 h。滴加0.35 mL正丁酰氯，再缓慢升温至80℃，反应24 h后，在室温下往反应液中加入20 mL水，依次经过萃取、洗涤、干燥、过滤后，将滤液浓缩，用色谱柱分离并旋干溶剂，即得结晶状EBD淡黄色固体。
2.2 EBDLN的制备采用薄膜分散法制备EBDLN。称取适量EBD、单硬脂酸甘油酯以及卵磷脂于适量无水乙醇中，充分溶解后除去溶剂，形成均匀分布的薄膜。加入均匀分散至二次蒸馏水中的吐温-80溶液，超声至薄膜完全脱落并溶解，即得乳白色EBDLN混悬液。
2.3 粒径和Zeta电位的测定取0.4 mL的EBDLN，用超纯水稀释至4 mL，混匀并经0.45 μm滤膜过滤后，立即用马尔文激光粒度电位仪测定。
2.4 包封率和载药量的测定采用凝胶柱层析法测定EBDLN的包封率和载药量。将溶胀好的葡聚糖凝胶G-50装入直径1 cm高度为30 cm的玻璃柱，静置3 h。吸取EBDLN混悬液，过葡聚糖凝胶柱，用20%的乙醇溶液洗脱，收集EBDLN洗脱液，以空白的固体脂质纳米粒作为对照，按照“2.7.2”项下条件，采用HPLC法测定峰面积，计算EBDLN中包封EBD的含量(M1)。吸取等量未过层析柱的EBDLN混悬液，用无水乙醇稀释至相同倍数，按照“2.7.2”项下条件，采用HPLC法测定峰面积，计算EBDLN混悬液中EBD的总含量(M2)。做3次平行实验，且计算制备EBDLN所需材料的总量(M0)，按以下公式计算包封率(EE%)和载药量(LE%)。
EE%=M1/M2×100%；LE%=M1/M0×100%。
2.5 体外释放实验采用动态透析法考察EBD和EBDLN在两种介质中的体外释药特征。分别以pH 1.20的HCl溶液和pH 6.80的PBS做为释放介质，将分别装有等量相同浓度EBD和EBDLN的密闭透析袋投入到上述两种释放介质中，并置于恒温水浴震荡器中搅拌(37℃，100 r·min-1)。分别于1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、148 h取出1 mL释放介质, 同时补充等温、等体积的释放介质。测定取样中EBD和EBDLN的含量，并绘制体外释药曲线。
2.6 在体胃肠吸收实验18只SD ♂大鼠实验前14 h禁食(可饮水)，分为3组，每组6只，用水合氯醛将大鼠麻醉并固定。沿大鼠腹中线打开腹部，在胃贲门处小心切合适长度并结扎，再将胃内容物用人工胃液清洗除净，用空气排净人工胃液后，从胃切口处注入药物溶液(EDM或EBD或EBDLN)，结扎幽门[9]。2 h后收集胃内药液，再用剩余灌流液冲洗，合并流出的液体并定容[9]。依次找到十二指肠、空肠、回肠、结肠，每个肠段量取10 cm，分别在肠段的两端插管并结扎，并将伤口用蘸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿。先用预热的37℃生理盐水以1 mL·min-1流速灌流，以洗净肠内容物，随即用空气排净生理盐水。再用Krebs-Ringer液冲洗管道10 min，空气排净Krebs-Ringer液后，换用预热到37℃的含药循环液(EDM或EBD或EBDLN)，灌流液进入肠段后立即计时，以0.2 mL·min-1流速灌流60 min后，用空气排出药液，并用Krebs-Ringer液冲洗管道数次。将灌流后的流出液、冲洗液及剩余灌流液合并后，用Krebs-Ringer液定容至25 mL。用HPLC方法测定EDM或EBD的质量浓度。实验结束后剪下各实验肠段，并测量各肠段长度与内径。药物在各肠段的有效渗透系数Papp和吸收速率常数Ka分别用以下公式计算[10]：Papp= Q·ln(Xin/Xout)/2πrL；Ka = (X0-Xt)/C0t。
2.7 EBD和EBDLN样品分析 2.7.1 样品处理精密量取100 μL经上述操作后得到的样品，加无水乙醇，涡旋，混匀，8 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液进行分析测定。
2.7.2 色谱条件的建立色谱柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(80：20)，柱温30℃，检测波长为240 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL。
2.7.3 标准曲线的绘制分别精密量取适量EBD溶液，用甲醇稀释，定容得到0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg·L-1的系列浓度的标准溶液。按“2.7.2”的色谱条件进样，记录峰面积并制作标准曲线。
2.7.4 方法学验证分别配制低、中、高(0.8、1.0、1.2 mg·L-1)共3种不同浓度的EBD甲醇溶液，按“2.7.2”的色谱条件进样，计算日内、日间精密度和回收率。
2.8 EDM样品分析参照晏声蕾等[1]的方法，对EDM样品进行处理并分析。
2.9 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件分析所有数据，检验方法为配对t检验(α=0.05)，数据以x±s表示。
3 结果 3.1 EBDLN的粒径和Zeta电位测得的EBDLN的平均粒径为(245.00±3.50)nm，多分散性指数PDI为(0.24±0.015)，Zeta电位为(-27.51±1.35)mV。
3.2 EBDLN的包封率和载药量制备了3批EBDLN，测定得到EBDLN的平均包封率为(86.31±0.32)%，平均载药量为(3.50±0.14)%。
3.3 EBD和EBDLN的体外释放以药物的累积释放率为纵坐标，取样时间为横坐标，绘制体外释放曲线。EBD和EBDLN在同一介质释放时，它们的释药趋势完全一致，但EBD有明显的突释效应，而EBDLN相对于EBD而言其释药速度更慢。这表明EBDLN改变了药物的释放行为，显示出缓释效应。由Fig 2、3曲线可见，在两种释放介质(pH 1.20 HCl和pH 6.80 PBS)中，EBD前60 min的累积释放率分别为(81.26±1.96)%和(92.94±1.68)%，但EBDLN在相应时间段内的累积释放率分别为(61.37±1.31)%和(65.81±1.68)%。且在120 min时，在两种介质中的EBD已基本释放完全，但EBDLN仍有持续释放的迹象。
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| Fig 2 In vitro release behaviors of free EBD and EBDLN in pH 1.2 HCl |
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| Fig 3 In vitro release behaviors of free EBD and EBDLN in pH 6.8 PBS |
以EBD的色谱峰面积(A)和它的质量浓度(C)做线性回归，方程为A=897.95 C+10.867 3 (r=0.999 3)，EBD浓度在0.2~2.0 mg·L-1的范围内线性良好。日内精密度RSD平均值为0.61%，日间精密度RSD平均值为0.82%，以上结果表明精密度符合分析要求。加样回收率平均值分别为99.72%、100.01%、99.89%，RSD为0.56%、0.43%、0.61%，实验结果表明回收率符合分析要求。
在体胃肠吸收实验结果表明，EBDLN明显增强了EDM和EBD在胃肠道的吸收。Fig 4、5结果显示，EBDLN在各个肠道的Ka值和Papp值均明显大于EDM和EBD。且EBDLN在胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠共5个肠段中的Ka值分别为EDM的110.14、56.70、51.23、45.70、127.23倍，EBDLN在十二指肠、空肠、回肠、结肠共4个肠段中的Papp值分别为EDM的9.74、4.48、3.82、11.30倍。经样本配对t检验结果显示，EBDLN与EDM在4个肠段中的在体吸收情况差异具有统计学意义(P < 0.05)。在灌流的所有肠段中，EDM和EBD在十二指肠中表现出的Ka值和Papp值最大，结果表明EDM和EBD在十二指肠中吸收最好，其次为结肠、空肠、回肠，在胃内吸收最差。而EBDLN在结肠中表现出的Ka值和Papp值最大，结果表明EBDLN在结肠中吸收最好，其次为十二指肠、空肠、回肠，在胃内吸收最差。以上结果也充分表明EBDLN、EBD和EDM的吸收部位主要是在小肠段，而在胃内吸收较少。将EDM经结构修饰再经制剂方法制备成EBDLN后，改变了EDM在小肠段的最佳吸收部位，即由药物在十二指肠吸收最佳变为了在结肠吸收最佳。
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| Fig 4 Absorption rate constant Ka of EBD and EBDLN in individual perfusion segments *P < 0.05, **P < 0.01 vs EDM |
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| Fig 5 Apparent permeability coefficient Papp of EBD and EBDLN in individual perfusion segments *P < 0.05 vs EDM |
EDM具有低水溶性和低渗透性[5]，导致胃肠吸收不佳，所以口服生物利用度极低。本文结合结构修饰和纳米制剂的优势，通过EDM合成EBD，并制备成了EBDLN，结果显示明显提高了药物的溶解性和渗透性，提高了EDM在吸收部位的渗透能力，以此达到增加口服生物利用度的目的。
SLN能将难溶性药物吸附或加载于脂质内核中，使其均匀分散在该纳米载体中，以达到增溶目的，形成粒径范围较宽的固体纳米给药体系，且生物机体能较好地容纳SLN，暂未见明显不良反应的报道[11]。与其他SLN的制备方法相比，薄膜超声法具有操作简单、快速可靠、包封率高，且辅料用量低的优点[12]，因此，本文采用薄膜超声法来制备EBDLN。由粒径和粒径分布结果可知，应用此法制备得到的纳米粒子粒径较小，且大小分布均匀(PDI < 0.50)，并能稳定存在，有效保证了抗癌的靶向性能，同时也能实现较高的药物包封率。由累积释放率结果可知，释放介质pH 6.80 PBS比pH 1.20 HCl更有利于EBD的释放，推测pH会影响药物的释放行为，且较大的pH环境可能有利于药物的释放。
EBDLN与晏声蕾等[1]制备的吴茱萸碱油包水型复合纳米乳WECNE的在体胃肠吸收情况相比较显示，EBDLN在各个肠道的Ka值和Papp值均明显大于WECNE。且EBDLN在胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠共5个肠段中的Ka值分别为WECNE的72.38、19.86、13.51、11.48、35.18倍，EBDLN在十二指肠、空肠、结肠的Papp值分别为WECNE的1.56、1.02、1.51倍。EBDLN与晏声蕾等[13]制备的吴茱萸碱水包油型复合纳米乳OECNE的在体胃肠吸收情况相比较显示, EBDLN在各个肠道的Ka值和Papp值均明显大于OECNE。且EBDLN在胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠共5个肠段中的Ka值分别为OECNE的47.50、20.67、15.23、11.05、46.45倍，EBDLN在十二指肠、空肠、结肠的Papp值分别为OECNE的2.09、1.20、3.09倍。以上结果说明EBDLN增强EDM的在体肠吸收能力远远大于WECNE[1]和OECNE[13]。EBDLN分别与胡江波等[14]制备的复方吴茱萸碱纳米乳和张雪等[15]制备的吴茱萸碱羟丙基-β-环糊精包合物相比较结果显示，EBDLN的Ka值和Papp值明显高于以上两个制剂，这也说明了在目前所能查到的所有关于EDM制剂的文献报道中，EBDLN在各肠段的在体吸收能力是最强的。
EBDLN表现出的高在体吸收能力的原因推测与以下几个因素有关：① EBD与EDM在化学结构上的差异。EBD比EDM多1个丁酰基团，从而使EBD整个分子的极性增大，这有助于化学药物水溶性的提高；②通过纳米制剂的技术，将EBD包载进入SLN后，由于纳米制剂的优越性能和所用各辅料的作用，如强脂溶性的单硬脂酸甘油酯和注射用大豆卵磷脂作为油相，且单硬脂酸甘油酯是非离子型的表面活性剂，在EBDLN这个制剂中作为乳化剂，使水相和油相能充分混合，形成完全均匀分散的乳浊液，进一步增强EBD的渗透性，使EBD更容易被肠道上皮细胞所吸收，且保持EBDLN的相对稳定性。
综上所述，本实验首次制备了EBDLN，并研究了它的体外释放和在体胃肠道吸收特征。研究发现EBDLN具有缓慢释药的特点，且明显提高了EDM和EBD在胃肠道的吸收，这有助于推广EDM在临床的使用。
( 致谢: 本实验在重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心完成，在此真诚感谢实验室的所有老师和同学。)
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