2. 广西医科大学第一附属医院 结直肠肛门外科，广西 南宁 530021
2. Dept of Colorectal and Anal Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
乳腺癌是导致妇女死亡的主要癌症之一，其中三阴性乳腺癌具有侵袭力强、转移性大、预后不良等生物学特点，三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌的15%~20%[1]。全身化疗是治疗三阴乳腺癌的主要方法，但其副作用大，预后并不是很理想。临床上，中药治疗恶性肿瘤已经有了明显的疗效[2]。金雀异黄酮(genistein)化学名称为5, 7, 4′-三羟基异黄酮，是许多中药重要的天然活性成分之一，广泛分布于大豆、三叶草、葛根、染料木(金雀花)、广豆根等豆科植物中，研究表明，金雀异黄酮具有抗癌及其他广泛的药理活性[3]。Phillip等[4]报道，金雀异黄酮能协同组蛋白去乙酰化酶抑制剂，诱导前列腺癌细胞死亡。我们前期研究表明，EGFR/PI3K/Akt通路参与金雀异黄酮诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的信号传导[5]，但细胞凋亡信号传递相当复杂，其中有许多不同通路参与，并互有交叉与对话。本次研究拟进一步探讨NF-κB和MAPK通路是否参与乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的信号传导。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购于中国科学院上海细胞库。DMEM高糖培养基购自美国Corning公司；金雀异黄酮、磷酸酶抑制剂(Cocktail)、噻唑蓝(MTT)、结晶紫购自美国Sigma公司；胎牛血清购自澳大利亚Excellbio公司；GAPDH、Bax、Bcl-2抗体购自美国ABclonal公司；NF-κB、caspase-3、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；荧光二抗购于EarthOx Life Science公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(加强型)、蛋白酶抑制剂PMSF购自中国碧云天生物技术有限公司。
1.2 细胞培养及药品储存液配制人乳腺癌MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基，常规培养于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中，每2~3 d传代。金雀异黄酮用DMSO配制成100 mmol·L-1的储存液，避光储存于-20℃冰箱中，实验时用DMEM培养基稀释成需要的浓度(DMSO终体积分数不超过0.1%)。
1.3 MTT实验将MDA-MB-231细胞以4 000个/孔接种于96孔板中，置于培养箱中培养12 h使细胞贴壁，吸弃培养基，每孔加入200 μL含有金雀异黄酮(0、12.5、25、50、100、150 μmol·L-1)的培养基，每组设置3个复孔，分别孵育24、36、48 h，加入20 μL 5 g·L-1的MTT，置于细胞培养箱中避光孵育4 h后，吸出孔内的液体，加入150 μL DMSO溶解结晶，在震荡器上避光震荡10 min使结晶充分溶解，在492 nm用酶标仪测定各孔的吸光度(A值)。细胞生长抑制率=(1-A给药组/A正常对照组)×100%。
1.4 细胞克隆实验将MDA-MB-231细胞以500个/孔接种到6孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h，使细胞贴壁，吸弃孔内培养基，加入2 mL含有金雀异黄酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培养基，置于细胞培养箱中孵育36 h，吸弃孔内培养基，更换新鲜的含有10%胎牛血清的培养基继续培养12 d(每3 d换1次液)，弃去孔内培养基，用PBS洗3遍，加入4%多聚甲醛室温固定20 min，再用PBS洗3遍，加入结晶紫室温染色20 min，再用PBS洗3遍，拍照计算集落形成抑制率。集落形成抑制率=[1-(集落数/种殖细胞数)]×100%。
1.5 Western blot实验将MDA-MB-231细胞接种于25 cm2的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养至80%汇合时，加入含有金雀异黄酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培养基，于细胞培养箱中孵育36 h，收集培养瓶内所有细胞，用PBS洗3遍，加入细胞裂解液(RIPA :PMSF :Cocktail=100 :1 :1)200 μL重悬细胞，静置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1离心30 min，提取上清液，用BCA法检测蛋白浓度。加入适量的上样蛋白缓冲液充分混匀，100℃高温7 min使蛋白质变性，取50 μg蛋白质，经10% SDS-PAGE电泳分离后，使蛋白转移至NC膜上，用5% BSA室温封闭60 min，一抗冰上孵育12 h，二抗室温孵育60 min，最后用双色红外荧光扫描成像系统扫膜采集图像，并分析灰度值。每组实验重复3次。
1.6 统计学分析实验结果以x±s表示，数据用SPSS 21.0软件进行统计分析，两组以上均数比较使用单因素方差分析，组间采用SNK法进行两两比较。
2 结果 2.1 金雀异黄酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响如Fig 1所示，随着药物浓度和作用时间的增加，金雀异黄酮对细胞生长的抑制率逐渐增加。金雀异黄酮干预MDA-MB-231细胞24、36、48 h的IC50值分别为(78.73± 0.98)、(61.74 ± 1.07)、(58.37±1.48)μmol·L-1。
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| Fig 1 The inhibitory effect of different concentrations of genistein on MDA-MB-231 cells proliferation (x±s, n=3) **P < 0.01 vs control (0 μmol·L-1) |
如Fig 2所示，不同浓度的金雀异黄酮(0、25、50、100 μmol·L-1)干预MDA-MB-231细胞36 h后，再培育12 d，与对照组相比，随着金雀异黄酮浓度升高，细胞的集落数明显降低，并呈现量效趋势(P＜0.01)。提示金雀异黄酮可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的集落形成能力。
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| Fig 2 Effect of genistein on colon formation of MDA-MB-231 cells and histogram of colony inhibitory rate (x±s, n=3) A: Control group; B: 25 μmol·L-1 genistein; C: 50 μmol·L-1 genistein; D: 100 μmol·L-1 genistein. **P < 0.01 vs control (0 μmol·L-1). |
如Fig 3所示，与对照组相比，金雀异黄酮干预MDA-MB-231细胞36 h后，Bcl-2蛋白表达明显下调(P＜0.01)，Bax、caspase-3蛋白表达明显上调(P＜0.01)。提示金雀异黄酮对凋亡相关蛋白Bax及caspase-3具有明显的诱导作用。
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| Fig 3 Effect of genistein on expression of apoptosis related proteins in MDA-MB-231 cells by Western blot x±s, n=3) **P < 0.01 vs control (0 μmol·L-1) |
如Fig 4所示，与对照组相比，金雀异黄酮呈浓度依赖性下调NF-κB (p65)和p-ERK蛋白的表达(P＜0.01)，而上调p-JNK蛋白的表达。提示金雀异黄酮诱导MDA-MB-231细胞凋亡可能与抑制NF-κB、ERK，激活JNK信号转导通路相关。
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| Fig 4 Effect of genistein on expression of NF-κB (p65), ERK, p-ERK, JNK and p-JNK proteins in MDA-MB-231 cells by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control (0 μmol·L-1) |
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程，目前研究发现的细胞凋亡途径主要有3条，分别为线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路[6]。抗肿瘤药物诱导细胞凋亡是其发挥药理作用的重要机制之一。本研究中，MTT和集落形成实验显示，金雀异黄酮能明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。我们进一步从蛋白水平探讨，Western blot检测显示，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达水平明显减少，而促凋亡的Bax蛋白表达水平明显提高。这些结果提示金雀异黄酮能明显抑制人三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，并诱导其凋亡，再次证实了我们既往的研究结果。
NF-κB是研究最多的转录因子之一，p65是其中一个重要的亚型转录因子。被活化的p65可以通过核转位参与机体免疫、组织损伤修复、胚胎发育等生理和病理过程的基因调控[7]。有研究表明，NF-κB与多种凋亡相关基因的易感性与耐药性密切相关，在细胞存活与凋亡过程中有着双向的作用。胞外各种刺激，如TNF-α、IL-6、IL-1、LPS等化学性或紫外线等物理性应激物，可通过细胞表面受体激活信号转导通路，从而激活NF-κB途径，促进细胞生长、恶性转化、耐药、肿瘤的转移等[8]。王晓南等[9]曾报道，雷公藤红素能诱导U937细胞凋亡，其机制可能与下调Notch1信号通路以及NF-κB蛋白表达有关。因此，抑制NF-κB活性可以抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、抑制化疗耐药、抑制炎症、减少肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞转移等生物学效应[10]。本研究中，金雀异黄酮可以明显抑制NF-κB (p65)蛋白表达水平，提示金雀异黄酮可以明显抑制NF-κB通路的信号传导。
MAPK包括JNK、p38和ERK。JNK静息状态位于细胞质中，当受到信号刺激活化后，JNK发生磷酸化成为p-JNK，部分p-JNK转入核内，通过磷酸化级联反应调控核内转录因子及基因表达，发挥相应的生物学效应。进一步研究发现，p-JNK也能活化p53和c-Myc2等核内转录因子[11]。某些胞质内的成分，如Bcl-2、Bcl-xL和Bim等也可以被JNK活化，表明JNK通路不仅可以调节核内基因转录，还可以直接作用于胞质底物而快速发挥生物学效应[12]。我们的研究显示，金雀异黄酮干预MDA-MB-231细胞后，JNK、p-JNK明显上调，提示金雀异黄酮可能通过激活JNK/MAPK通路，参与细胞凋亡信号传递。
ERK是Ras-Raf-MAPK通路中的一种下游蛋白激酶，ERK1和ERK2是ERK通路中最重要的两个成员[13]。未激活的ERK1/2都位于胞质内，ERK1/2一旦被激活则被磷酸化形成p-ERK1/2移位至细胞核，然后通过调节多种转录因子，如c-Myc、c-jun、NF-κB等的活性，最终影响细胞代谢和功能，并产生特定的生物学效应[14]。ERK在细胞的增殖、分化和凋亡中起着重要作用，ERK一方面能诱导Bcl-2等抗凋亡基因的表达发挥抗凋亡作用，另一方面，p-ERK1/2升高又能激活凋亡相关基因caspase-3等而发挥促凋亡作用[15]。我们的研究也显示，金雀异黄酮干预MDA-MB-231细胞后，p-ERK的表达明显降低，提示金雀异黄酮可能通过抑制ERK通路，诱导MDA-MB-231细胞凋亡。
综上所述，本研究显示NF-κB、JNK和ERK信号通路可能参与了金雀异黄酮诱导MDA-MB-231细胞凋亡信号的转导，结合既往研究，提示金雀异黄酮呈多通路发挥抗肿瘤效应。
( 致谢: 本实验于广西医科大学医学科学实验中心完成，感谢实验室老师和同学的指导和帮助！)
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