肺高压(pulmonary hypertension，PH)是由许多因素引发的以肺血管重塑、肺血管收缩升高、原位血栓的形成为典型病理改变的一类临床病理生理综合征。肺血管阻力、肺血管压力持续性升高，肺血流受限，最终会导致右心衰竭，甚至死亡^[1]。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的收缩和增殖参与了PH发展过程中持续的肺血管收缩和血管重塑^[2]，而胞质内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)的增加是PASMCs收缩和增殖的主要诱因和重要刺激^[3]。钾通道是细胞内钾离子(K⁺)转移至细胞外的主要途径，在调节膜电位、[Ca²⁺]_i、血管平滑肌收缩等方面都发挥着重要作用^[4]。电压依赖性钾通道(voltage-depending potassium channel，K_V)作为最常见的钾通道家族，广泛表达于PASMCs细胞膜。研究发现，K_V故障与PH的产生和发展有很大关联，抑制K_V会引起细胞内K⁺积聚，导致细胞膜发生去极化，进而激活L型电压门控Ca²⁺通道，胞外Ca²⁺进入细胞内，增加[Ca²⁺]_i，使得肺血管持续性收缩，而持续的血管收缩最终会影响PASMCs的增殖和凋亡，引起肺血管重构^[5]。我们的前期研究表明，PH大鼠模型PASMCs中[Ca²⁺]_i明显提高，各类Ca²⁺通道功能明显增强^[6]，但是PASMCs中K_V的功能还有待进一步的研究。因此，本文使用慢性低氧(chronic hypoxia，CH)、野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的两种PH大鼠模型，探讨钾通道阻滞剂四乙基铵(tetraethylammonium，TEA)敏感性K_V电流的电生理特性及其在PH中的变化。

1 材料与方法 1.1 试剂

氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl₂)、氯化钙(CaCl₂)、HEPES、EGTA、二甲基亚砜(DMSO)，均购自Sigma公司。野百合碱(MCT，Sigma)配制方法：首先采用HCl(1 mol·L^-1)溶解，其次用NaOH(1 mol·L^-1)，使得溶液pH为7.0，最后用双蒸水定容成2%溶液，现配现用。TEA(Sigma)用双蒸水配成2.5 mmol·L^-1的贮存液备用。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.1 钾通道电流电极内液的配制

电极内液(mmol·L^-1)：KCl 35、Mg-ATP 5、葡萄糖酸钾90、NaCl 10、GTP 0.5、HEPES 10，用5 mol·L^-1 KOH调节pH至7.2。高浓度ATP用于阻断ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K⁺ channels，K_ATP)电流，电极内液无Ca²⁺，最大限度阻断钙离子激活性钾通道(Ca²⁺-activated K⁺ channels，K_Ca)电流，以保证记录到的钾电流基本为K_V电流。

1.1.2 通道灌流液的配制

通道灌流液(mmol·L^-1)：葡萄糖5.2、NaCl 136、HEPES 10、KCl 5.4、CaCl₂ 1.8、MgCl₂ 1.2，用3 mol·L^-1 NaOH调节pH至7.4。

1.2 肺高压模型的建立 1.2.1 CH肺高压模型的建立

清洁级♂ SD大鼠(体质量200~220 g)，购自福建医科大学实验动物中心[SCXK(闽)2012-0001]，随机分为正常对照组、CH组。将两组动物同时放于密封的有机玻璃饲养箱内，CH组饲养箱内氧分压调至9.5%~10.5%，对照组箱内维持正常氧分压，常规饲养3周，正常饮食饮水，饲养箱每天定时清理。

1.2.2 MCT肺高压模型的建立

清洁级♂ SD大鼠(体质量150~160 g)，随机分为对照组和MCT组。MCT组采用50 mg·kg^-1的剂量一次性腹腔注射MCT(2%)，对照组则采用相同的方法给予等体积生理盐水，常规饲养3周，正常饮食饮水。

1.3 右心室内压测定

各组大鼠饲养3周后，用20%乌拉坦(0.5 g·kg^-1)腹腔注射麻醉，并行腹腔肝素化(500 IU·kg^-1)处理，迅速分离右颈外静脉，经静脉行右心室(right ventricle, RV)插管术，PE₅₀管(0.6mm ID×0.9mm OD)成功进入RV后，对各组的右心室收缩压(right ventricular systolic pressure, RVSP)进行记录。

1.4 右心室重量指数计算

右心室内压测定结束后，对动物实施安乐死，随后快速剖开胸腔，并取出心、肺组织，置于滤纸上，沿心脏房室交界剪去左右心房和周围大血管组织，完整保留左右心室，随后沿室间隔分离RV，反复用滤纸吸干其上的血液和水分，最后用分析天平称重。将左心室与室间隔(left ventricular wall plus septum, LV+S)剖开，同样用滤纸吸干其上的血液和水分，然后采用分析天平进行称重，最后计算右心室质量指数(right ventricular mass index, RVMI)：RVMI= RV/(LV+S)。

1.5 PASMCs培养及鉴定

各组大鼠血流动力学测定结束后，开胸取出心肺，在HEPES缓冲盐溶液(HBSS)中分离肺叶内动脉，用棉签去血管内皮，然后将动脉放置于4℃的HBSS中，恢复20 min。将血管组织置于37℃含胶原蛋白酶I、木瓜蛋白酶、牛血清蛋白的酶溶液中消化20 min，取出，并用无Ca²⁺的HBSS终止消化。将细胞混悬液置于35 mm培养皿，并用含1% FBS、100 kU·L^-1链霉素和0.1 g·L^-1青霉素的F-12培养基培养12~24 h。

对培养12~24 h的PASMCs进行免疫组织化学鉴定。首先将细胞滴在培养皿中的玻璃片中央进行培养，后用PBS清洗细胞3次，4%多聚甲醛室温固定30 min; 再用PBS冲洗5 min×3次，用蒸馏水冲洗，0.3% H₂O₂室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS冲洗5 min×3次; 滴加封闭血清，室温孵育40 min，倾去多余液体; 滴加鼠抗actin单克隆抗体(1 :400)，阴性对照采用PBS，4℃湿盒孵育过夜，然后在37℃复温45 min，PBS冲洗5 min×3次; 滴加生物素标记羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次; 滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次; DAB显色剂显色，然后在显微镜下观察，掌握显色程度，蒸馏水充分冲洗终止染色; 苏木精复染2 min; 乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性结果判断：胞质内呈棕褐色丝状条纹沉淀。

1.6 全细胞膜片钳技术测定钾电流

取培养12~24 h的PASMCs于细胞记录槽内，用细胞外液灌流; 玻璃微电极(电阻3~5 MΩ)内充灌正常或含2.5 mmol·L^-1 TEA的电极内液。选择贴壁良好、形态规则、细胞膜光滑完整且折光性好的大鼠PASMCs，记录细胞膜的K_V电流。钳制电位为-80 mV，阶跃电压10 mV，给予从-80 mV至+60 mV的去极化脉冲刺激，并用pClamp软件分析。

1.7 统计学处理

计量数据以x±s表示，单个实验组和对照组间差异用成组t检验进行统计学分析，模型组和对照组间差异用ANOVA方差分析。标准曲线以及原始曲线的绘制采用Sigma Plot 11.0软件。

2 结果 2.1 PH模型的鉴定

如Fig 1所示，与对照组相比，CH组、MCT组的RVSP和RVMI均明显升高(P < 0.01)，其中CH和MCT模型构建成功率高达80%，表明CH和MCT均能够引起大鼠肺动脉压力的明显升高，导致右心室肥厚，PH模型构建成功。

2.2 PASMCs的免疫化学鉴定

取原代培养的大鼠PASMCs进行免疫组织化学染色(Fig 2)，Fig 2A为阴性对照，Fig 2B为阳性对照。在高倍镜下可见细胞核呈淡蓝色，卵圆形居中，阳性对照胞质内呈棕褐色丝状条纹沉淀，即可判断为PASMCs。

2.3 TEA对对照组K_V电流的影响

-80 mV钳制电压下，给予去极化脉冲刺激从-80 mV到+60 mV，阶跃电压10 mV，记录K_V特异性阻滞剂TEA(2.5 mmol·L^-1)对PASMCs K_V电流的影响。Fig 3结果显示，PASMCs在阶跃电压刺激下，随刺激电压强度的增加，K_V电流也随之变大，并且形成I-V曲线[pA/pF：(40.06±3.08)，Fig 3A]。TEA干预后，PASMCs的I-V曲线明显减小[pA/pF：(17.68±2.01)，P < 0.01，Fig 3B]。表明TEA能够明显抑制PASMCs K_V电流的I-V曲线，但是对K_V电流的形态无明显影响。

2.4 K_V电流在对照组中的变化及TEA的干预作用

为进一步观察K_V电流在CH致PH大鼠PASMCs中的变化，在相同钳制电压和阶跃电压下，去极化脉冲刺激后记录K_V电流。结果显示，与正常组相比，CH组PASMCs K_V电流I-V曲线明显减小[pA/pF：(36.19 ± 3.18)，P < 0.05，Fig 4A]，表明CH处理能够降低大鼠PASMCs K_V电流。随后，观察K_V抑制剂TEA对CH大鼠PASMCs钾电流的干预作用，结果显示，与加药前相比，TEA明显抑制CH组K_V的I-V曲线[pA/pF：(15.50±3.64)，P < 0.01，Fig 4B]。表明TEA同样能够明显抑制CH大鼠PASMCs中K_V电流的I-V曲线，而K_V电流I-V曲线的形态在加药前后无明显变化。

2.5 K_V电流在MCT大鼠中的变化及TEA的干预作用

我们继续观察了MCT预处理对PASMCs中K_V电流的影响，相同钳制电压和阶跃电压下，给予相同的去极化脉冲刺激，记录MCT致PH大鼠K_V电流。结果显示，与正常组相比，MCT组K_V电流I-V曲线明显降低[pA/pF：(26.26 ± 4.14)，P < 0.01，Fig 5A]，且比CH组降低的更明显，表明MCT预处理能够明显降低大鼠PASMCs K_V电流。继续观察TEA对MCT组K_V电流的干预作用，结果显示，TEA作用后，MCT大鼠K_V的I-V曲线明显降低[pA/pF：(18.76±4.47)，P < 0.01，Fig 5B]。表明K_V抑制剂TEA明显抑制MCT大鼠PASMCs中K_V电流的I-V曲线，而对I-V曲线的形态无明显影响。

2.6 TEA的抑制作用在PH大鼠中的变化

最后，观察CH和MCT诱导的PH大鼠中TEA对K_V电流抑制作用的变化。利用pClamp分析软件将加TEA之前的K_V电流曲线减去同一细胞加药后的电流曲线，即为TEA敏感性钾电流曲线，也代表了TEA对细胞K_V电流的抑制作用。因此，我们通过分析不同组别PASMCs中TEA敏感性钾电流的大小，反映TEA对K_V电流抑制作用的强弱。结果显示，与正常组(30.09 ± 2.81)比较，CH组PASMCs的TEA敏感性钾电流减小至(4.57 ± 0.54)(P < 0.01)，MCT组的TEA敏感性钾电流减小至(2.36 ± 0.76)(P < 0.01)，差异具有统计学意义(Fig 6)。以上结果表明，TEA敏感性钾电流在CH和MCT诱导的PH大鼠明显减小，即TEA对PASMCs中K_V电流的抑制作用明显降低。

3 讨论

研究表明，CH刺激可以使肺动脉收缩，血管张力升高，PASMCs多种Ca²⁺通道蛋白表达和功能增强^[7-10]，引起胞内Ca²⁺稳态失衡，同时CH能够抑制PASMCs凋亡，促进细胞增殖^[11]，引起PH。MCT可直接损伤肺血管内皮，使内皮胶原纤维裸露，导致肺血管血栓，并引发PASMCs增生等多种病理改变，引起肺血管壁重塑，最终形成PH^[12]。研究表明，K_V参与调节PASMCs的静息膜电位，决定肺血管张力^[10]。抑制钾通道，使细胞膜发生去极化，引起K_V开放，最终使得[Ca²⁺]_i提升，血管收缩性加强^[11]。因此，钾通道一直是治疗PH的重要靶点。

本研究使用全细胞膜片钳技术，首先在正常大鼠PASMCs上观察了K_V特异性阻滞剂TEA对K_V电流的影响。结果显示TEA干预后，PASMCs上记录到的K_V电流明显减小，表明TEA特异性阻断了PASMCs细胞膜上的K_V，使自由通过通道的K⁺明显减少，导致形成的钾电流减小，该研究结果与文献报道基本一致。有研究表明，CH刺激下PASMCs细胞膜上的K_V通道的活性与PH的发生、发展及肺血管的重塑密切相关^[10]，CH处理可明显抑制PASMCs的K_V通道活性，从而使Ca²⁺通道开放，最终导致PH的形成。本研究的结果与此基本一致，CH组的K_V电流明显减小，且TEA干预后同样明显抑制CH大鼠中记录到的K_V电流。

MCT作为一种较为成功的PH模型，它的代谢产物野百合吡啶能破坏肺动脉内皮细胞，促进PASMCs增殖，而PASMCs增殖过度又会引发肺血管重塑。本研究中，从电流密度-电压关系曲线图中，我们观察到MCT诱导的PH大鼠PASMCs的K_V电流明显减小，且与CH组相比，MCT诱导的PH大鼠K_V电流被抑制的更明显。同样，TEA干预后，明显抑制MCT大鼠PASMCs上记录到的K_V电流。CH和MCT诱导PH大鼠中K_V电流密度明显减小，同时，TEA敏感性钾电流也明显减小，TEA对PASMCs中K_V电流的抑制作用明显降低。提示PH大鼠模型PASMCs上的K_V通道的数量或者活性减小，同时具体是哪种类型的K_V作用减小还有待进一步研究。

综上所述，CH和MCT诱导的PH能够明显抑制大鼠PASMCs上K_V的开放，使得通过的K_V电流明显减小; K_V特异性抑制剂TEA可以阻断正常大鼠和PH大鼠PASMCs上的K_V，明显降低钾电流。因此，明确PH大鼠PASMCs钾电流的变化有助于揭示PH的发病机制，对于针对PH的新药研究具有非常重要的意义。

( 致谢: 非常感谢美国Johns Hopkins大学医学院肺及重症医学系James S.K. Sham教授在实验设计和膜片钳技术操作中给予的无私帮助。)