芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是课题组对白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)的主要有效成分芍药苷(paeoniflorin, Pae)结构进行酯化修饰，合成的新型活性单体。研究表明，TGP和Pae均具有抗炎免疫调节作用，可明显抑制关节炎大鼠的关节肿胀，改善关节、脾脏和肠系膜淋巴结病理变化。然而，Pae生物利用度低，导致其起效慢。课题组前期研究表明，CP-25(25、50、100 mg·kg-1)对佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠有确切的治疗作用，不仅可以明显减轻AA大鼠关节炎症，改善滑膜细胞异常增殖[1];还具有免疫调节作用，可以调节树突状细胞的功能[2]，改善AA大鼠脾脏的病理[3]，包括减轻白髓增生和红髓充血，减少动脉周围淋巴鞘细胞密度，减轻淋巴小结、边缘区和生发中心增生，但具体机制不清楚。外周淋巴组织淋巴细胞选择性的游走及归巢主要由趋化因子介导。趋化因子CXCL12及其受体CXCR4通过介导T、B细胞的迁移、增殖和活化，参与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的免疫反应[4]。RA病人的关节滑膜、滑液和血液中CXCL12的水平明显高于正常人[5]，但RA时脾脏中CXCL12/CXCR4的表达情况，以及脾脏的病理改变是否与CXCL12/CXCR4有关，仍不清楚。
本研究在前期研究的基础上，成功建立AA模型，采用CP-25的有效浓度(50 mg·kg-1)给药，观察脾脏组织的病理结构改变、脾脏中CXCL12和CXCR4的表达，探讨AA脾脏病理改变与CXCL12/CXCR4的关系，以及CP-25免疫调节作用的机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，体质量(180±20)g，清洁级，购于安徽医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。
1.1.2 药物与试剂CP-25由本所药化室提供，白色结晶状粉末，纯度大于98%;卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)购自北京生物制品所; CXCL12 ELISA试剂盒购于武汉华美公司; CXCL12、CXCR4抗体购于Abcam公司; ECL发光显色试剂盒购于Thermo Scientific公司。
1.1.3 仪器Olympus显微成像系统; ImageQuant LAS 4000荧光及化学发光成像系统(美国GE公司); BioTek Elx×808酶标仪(美国BioTek公司); RM2135石蜡切片机(德国莱卡)。
1.2 方法 1.2.1 AA模型的建立将80℃水浴灭活1 h的BCG与高压灭菌的石蜡充分研磨混匀，制成10 g·L-1的CFA，于每只大鼠右后足跖皮内注射0.1 mL致炎，造模当天设为d 0。将造模成功的大鼠随机分为模型组、CP-25(50 mg·kg-1)组、MTX(0.5 mg·kg-1)组，同时设置正常对照组。造模后d 14开始给药，d 28处死大鼠。CP-25按照50 mg·kg-1体质量灌胃给药，每天1次; MTX按照0.5 mg·kg-1体质量灌胃给药，每3 d一次。
1.2.2 脾脏病理学观察造模后d 28，分别将正常对照组、模型组、CP-25组和MTX组大鼠放血处死，迅速剪开大鼠腹部，分离、留取脾组织，剪取部分脾组织置于4%甲醛溶液中固定，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，制作病理切片(厚约5 μm)，经HE染色后，观察脾脏组织病理改变，进行病理评分。脾脏病理从动脉周围淋巴鞘(periarteriolar lymphoid sheath，PALS)的细胞密度、淋巴小结(lymphoid nodule，LN)增生进行判定，按照病变从轻到重，进行0~3级病理评分。PALS细胞密度评分：0=正常; 1=细胞密度轻微增大; 2=细胞密度中度增大，有细胞拥挤; 3=细胞密度重度增大，有细胞叠加。LN增生评分：0=正常; 1=轻微增生，可见生发中心; 2=中度增生，生发中心明显; 3=过度增生，生发中心多见。
1.2.3 免疫组化法检测脾脏组织中CXCL12和CXCR4水平脾脏组织制作病理切片后，经脱蜡水化，细胞通透，抗原修复，稀释相应比例的CXCL12和CXCR4的一抗，4℃过夜，二抗孵育，显色剂显色后封片。采集400倍视野图像，利用Image-Pro Plus分别对各切片中免疫组化染色阳性表达进行半定量分析，测定脾脏组织中CXCL12和CXCR4蛋白染色平均光密度(mean optical density，MOD)值后，进行统计学分析。
1.2.4 Western blot检测脾脏组织中CXCR4水平剪取部分脾组织，常规裂解(RIPA :PMSF=99 :1)充分研磨后，Lowry法蛋白定量，加蛋白上样缓冲液，沸水煮8 min，取15 μL蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，脱脂奶粉/TPBS封闭2 h，放入稀释相应比例的CXCR4一抗，4℃过夜，加入稀释的二抗，室温孵育2 h。ECL试剂盒显影。结果采用凝胶成像系统扫描后，以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。
1.2.5 ELISA检测脾脏组织中CXCL12水平剪取各组大鼠脾组织0.15 g，分别加PBS 100 μL，充分研磨后，离心取上清，用ELISA试剂盒测CXCL12的表达。
1.3 统计学分析数据分析应用SPSS 16.0软件处理，计量资料以x±s表示，各组数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用SNK检验。脾脏病理评分与CXCL12/CXCR4的相关性分析采用Pearson积矩相关系数。
2 结果 2.1 CP-25对AA大鼠脾脏病理的影响Fig 1 HE染色结果显示，正常对照组大鼠脾脏结构清晰，红髓与白髓界限较明显; 与正常对照组相比，AA组大鼠红髓与白髓界限模糊，红髓充血，白髓增生，PALS的细胞密度增加，LN增多，CP-25可以减少PALS的细胞密度，改善LN增生。
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| Fig 1 Effect of CP-25 on histopathology of spleen in AA rats(×100) A: Normal; B:AA; C: CP-25 50 mg·kg-1; D: MTX 0.5 mg·kg-1; E: Histopathological score of spleen(x±s, n=4). *P < 0.05, **P < 0.01 vs AA. |
ELISA结果显示，与正常对照组相比，AA组大鼠脾脏中CXCL12的表达明显升高(P < 0.05);与AA组相比，CP-25组和MTX组中CXCL12表达下降(P < 0.05)(Fig 2A)。免疫组化结果显示，各组脾脏淋巴细胞胞质均呈免疫阳性反应; 与正常对照组比较，AA组大鼠脾脏中CXCL12表达增强(P < 0.05);与AA组比较，CP-25组和MTX组中CXCL12表达减弱(P < 0.05)(Fig 2B~2F)。
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| Fig 2 Effect of CP-25 on expression of CXCL12 in spleen of AA rats(x±s, n=6) A: ELISA results of CXCL12; B: Normal; C: AA; D: CP-25 50 mg·kg-1; E: MTX 0.5 mg·kg-1; F:MOD of CXCL12. #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs AA. |
Western blot结果显示，AA大鼠脾脏中CXCR4表达较正常对照组增加(P < 0.01)，CP-25和MTX可以降低脾脏中CXCR4的表达(P < 0.05)(Fig 3A)。免疫组化结果显示，各组脾脏淋巴细胞胞质均呈免疫阳性反应; 与正常对照组比较，AA组大鼠脾脏中CXCR4表达增强(P < 0.05);与AA组比较，CP-25组和MTX组中CXCR4表达减弱(P < 0.05)(Fig 3B~3F)。
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| Fig 3 Effect of CP-25 on expression of CXCR4 in spleen of AA rats A: Western blot (x±s, n=3); B: Normal; C: AA; D: CP-25 50 mg·kg-1; E: MTX 0.5 mg·kg-1; F: MOD of CXCR4 (x±s, n=6). #P < 0.05, ##P < 0.01 vs normal; *P < 0.05 vs AA. |
相关性分析结果显示，脾脏组织的PALS和LN增生的病理评分与脾脏组织中CXCL12和CXCR4的表达之间均存在正相关(Fig 4)。CP-25改善脾脏病理改变可能与下调脾脏中CXCL12/CXCR4的表达有关。
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| Fig 4 Correlation between pathological changes of spleen and expression of CXCL12/ CXCR4 |
AA模型是一种T细胞依赖的免疫性炎症动物模型，在临床表现和病理机制等方面与RA有许多相似特征，是研究RA病理机制的较理想动物模型[6]。脾脏是人体最大的免疫器官，正常脾脏由白髓和红髓组成，白髓是淋巴细胞的聚集区，由PALS和LN组成。红白髓交界处的边缘区富含T、B淋巴细胞，是抗原提呈、启动免疫应答的场所。PALS主要由大量的T细胞构成，RA时大量T细胞异常活化，增殖分化为效应T细胞，这些T细胞浸润在滑膜组织和关节液，产生大量的促炎细胞因子，导致滑膜炎症和关节破坏[7]。淋巴小结主要由大量B细胞构成，是B细胞活化和分化为浆细胞、记忆B细胞的场所。活化的B细胞通过抗原提呈参与T细胞的活化，通过产生自身抗体和记忆B细胞维持RA自身免疫反应的持续存在[8]。病理结果显示，AA模型大鼠脾脏白髓与红髓界限模糊，白髓增生，动脉周围淋巴鞘细胞密度增加，淋巴小结增生，提示AA时脾脏中T、B细胞聚集，发生免疫应答。
CXCL12属于趋化因子家族，又称为基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，具有多种生物功能，如干细胞动员、炎性细胞浸润和血管生成，参与各种疾病过程，如癌症、艾滋病、自身免疫性疾病和缺血性疾病等[9]。CXCL12有两种受体，即CXCR4和CXCR7，主要通过CXCR4发挥作用，CXCR4是7次跨膜G蛋白偶联受体[10]。在RA的滑膜组织及关节液中CXCL12的水平增加，CXCL12可以促进血管形成[11]，介导表达CXCR4的T细胞和B细胞向滑膜组织迁移[4]。CXCL12促进软骨细胞分泌MMP-1、MMP-13，使软骨降解，使用CXCR4受体拮抗剂AMD3100可以降低滑膜液中MMP-1和MMP-13的水平[12]，改善胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠的全身表现。这些研究表明，CXCL12/CXCR4有利于炎性效应细胞向关节迁移并且滞留，促进新生血管形成，从而推动炎性过程发展，在RA的发病机制中发挥重要作用。但CXCL12/CXCR4是否与RA的脾脏病理改变有关仍不清楚。本实验结果显示，AA大鼠脾脏PALS细胞密度和LN增生，均与CXCL12以及CXCR4的表达水平存在正相关，提示CXCL12/CXCR4与AA脾脏的病理改变有关，可能通过趋化作用，促进淋巴细胞在脾脏的聚集，其具体的作用及机制有待进一步研究。
CP-25是课题组对TGP的主要有效成分Pae进行结构修饰，合成的新型活性单体。研究表明，Pae能明显抑制CIA大鼠B淋巴细胞增殖，降低血清中IgA、IgG和IgM水平，降低血清中B细胞刺激因子和脾脏BAFF-R表达[13]。Pae抑制关节炎模型大鼠滑膜细胞增殖，降低IL-1、TNF-α和PGE2等促炎性细胞因子分泌[14]。然而Pae生物利用度低，导致其起效慢。前期研究发现，CP-25 (25、50、100 mg·kg-1)对AA大鼠具有明显的抗炎和免疫调节作用，可以减轻AA大鼠的关节肿胀，改善关节、脾脏病理变化，减少巨噬细胞活化，减少血清中促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的水平，上调抗炎细胞因子TGF-β1的水平[3]。CP-25通过调节PGE2-EP4-cAMP和TNF-α-TNFR1-TRADD-TRAF2-NF-κB信号通路，调节树突细胞功能[2]。CP-25可以抑制滑膜细胞的异常增殖，下调滑膜细胞分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[1]。本实验发现，AA大鼠给予CP-25或者MTX后，CXCL12和CXCR4表达减少，脾脏PALS的细胞密度减少，LN增生得到改善，且脾脏的这些病理改变与CXCL12/CXCR4的表达呈正相关，提示CP-25可能通过减少AA大鼠脾脏组织中CXCL12和CXCR4的表达，减少淋巴细胞向脾脏的迁移，从而改善脾脏的病理改变，减轻免疫反应，发挥免疫调节作用。MTX作为RA的治疗药物，可以降低炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-3等水平，但由于免疫抑制作用，产生一些副作用，如骨髓抑制、胃肠道反应、皮疹、过敏性肺炎等[15]。在本实验中，MTX作为阳性对照药的作用与CP-25相似，但在实验过程中出现老鼠体质量下降、食欲不振、缺乏运动等现象，而CP-25给药组未出现此现象，这也与前期课题组研究结果相符，表明CP-25的耐受性好。因此，作为一种有前景的治疗RA的药物，不良反应少可能是CP-25的优势。
综上所述，CXCL12及其受体CXCR4的高表达与AA脾脏的病理改变有关，可能是通过趋化作用促进淋巴细胞在脾脏的聚集，从而促进AA脾脏中免疫反应的发生; 抑制AA大鼠脾脏中CXCL12和CXCR4的表达可能是CP-25发挥免疫调节作用的机制之一。
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