2. 安徽医科大学附属省立医院 病理科，安徽 合肥 230001
2. Dept of Pathology, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001, China
糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是一种常见的糖尿病慢性微血管并发症，表现为进行性白蛋白尿，随后肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)逐渐下降，导致肾衰竭伴有足细胞损失、进行性肾小球硬化和肾小管间质性纤维化[1]。其发病与慢性高血糖、炎症、氧化应激、肾小球血流动力异常等有关[2]。二甲双胍(metformin, MET)是广泛使用的一线抗糖尿病药物，近来研究显示，其可减少DKD患者的尿蛋白排泄，对糖尿病肾脏病变有一定的保护作用，但机制尚不十分明确[3]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, SIRT1)涉及多种疾病的发病机制，包括肾脏疾病[4]。研究显示，营养感受途径的改变，如雷帕霉素靶蛋白敏感型复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)、SIRT1与糖尿病肾损伤的发病机制有关[5]。在营养过剩的条件下，mTORC1、AMPK活化和SIRT1的活化减少，可能抑制自噬，而自适应自噬可以对抗糖尿病状态下的细胞应激，保护肾实质细胞[6]。本研究观察二甲双胍对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠肾组织SIRT1表达的影响，初步探讨二甲双胍对T2DM大鼠肾脏组织的保护作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物清洁级8周龄♂ SD大鼠，体质量180~220 g，购自安徽医科大学动物中心。所有动物自由饮食和饮水，适应性喂养1周后开始实验。实验期间湿度48%，室温控制为(19±1)℃，照明、黑暗12 h交替。
1.1.2 药物与试剂二甲双胍购自上海施贵宝公司; 链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购自Sigma公司; 白蛋白放射免疫试剂盒购自天津市协和公司; 肌酐、尿素氮试剂盒购自南京建成科技公司; TRIzol、引物和PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司; 格列本脲(glibenclamide, GLY)购自天津太平洋公司; SIRT1免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司; 尿SIRT1 ELISA试剂盒购自上海艾来萨生物科技公司。
1.1.3 仪器DG-3022A型酶联免疫检测仪(江苏南京国营华东电子管厂); DFM-96型10管放射免疫计数仪(安徽合肥众成机电公司); DS-5型糖化血红蛋白检测仪(英国DREW公司); NDl000紫外/分光光度仪(美国Nano-Drop公司); ABI7500型扩增仪(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 T2DM大鼠模型的建立、分组及给药44只SD大鼠，随机分为正常组10只和模型组34只。正常组大鼠给予普通饲料饲养，模型组大鼠给予高脂饲料(含88%常规饲料、10%猪油、2%胆固醇)。饲养4周后，禁食不禁水12 h，然后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)建立T2DM大鼠模型。造模72 h后，大鼠禁食不禁水8 h，尾静脉采血测定血糖≥16.7 mmol·L-1为造模成功。共30只造模成功，随机分为糖尿病组、二甲双胍(300 mg·kg-1·d-1)治疗组和格列本脲组(5 mg·kg-1·d-1)，每组均为10只，灌胃给药，每天1次，连续8周，T2DM大鼠继续高糖高脂饲料喂养。
1.2.2 标本的采集干预治疗8周后，用代谢笼收集12 h尿液，混匀后留取尿液5 mL，置于-40℃冰箱中，待测尿肌酐、尿SIRT1和尿白蛋白。收集尿标本后，各组大鼠在10%的水合氯醛腹腔注射麻醉下，行腹主动脉插管采集血标本，待测血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)。取出大鼠的双肾组织，用生理盐水反复灌洗，去除包膜，右肾部分组织放置于液氮中保存，留做real-time PCR，其余肾脏组织用来观察肾脏的病理变化。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 生化指标的检测尿肌酐检测使用苦味酸比色法，尿SIRT1检测采用ELISA法，血尿素氮检测使用尿酶法，尿白蛋白检测使用放射免疫分析法。尿SIRT1及尿白蛋白排泄取其与尿肌酐的比值来表示，以排除尿液稀释的影响，表示为尿SIRT1肌酐比(urinary SIRT1/urine creatinine，USIR)和尿白蛋白肌酐比(urinary albumin/urine creatinine, UACR)。
1.3.2 免疫组化检测肾组织SIRT1蛋白表达石蜡切片脱蜡水化; 滴加3% H2O2，在室温下孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶; 用PBS冲洗5 min×3次; 滴加10%的正常山羊血清封闭液，置于室温下20 min; 滴加一抗(SIRT1稀释浓度为1 :200)，4℃冰箱过夜; 次日用PBS洗3 min×3次; 滴加二抗，放置于37℃温箱内孵育30 min，用PBS清洗3 min×3次; 用DAB显色; 自来水冲洗，复染后脱水至透明，封片。每张切片选取3个视野拍照，采用全自动图像分析系统(Image Pro Plus 6.0)测定图像阳性反应部分的面积及相应的累积光密度(integral optical density, IOD)，选取各切片阳性物质的相对含量，用SIRT1IOD表示。
1.3.3 Real-time PCR法检测肾组织SIRT1 mRNA表达用TRIzol法提取肾组织RNA，提取2 μg总RNA逆转录为cDNA，产物分别进行SIRT1及β-actin的扩增。SIRT1引物序列为上游：5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′，下游：5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′; β-actin引物序列为上游：5′-GCCTTAGCCTGGACCCATAG-3′，下游：5′-GACCACCAATCCACACAGA-3′。使用ABI7500型扩增仪，在20 μL反应体系下运用荧光染料法，95℃预变性30 s; 95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min的热循环40次; 95℃15 s、60℃ 1 min及95℃ 15 s循环1次。内参和目的片段分别同批扩增，每组同时设置3个复孔，采用ΔΔCt法分析Ct值, 2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表达的拷贝数与β-actin拷贝数之比。
1.3.4 电镜观察取部分肾皮质在2.5%戊二醛室温下固定30 min，制作成超薄切片，在10 000倍下采取10个视野，并随机选取8处，测量肾小球基底膜厚度(glomerular basement membrane thickness, GBMT)，求其平均值。电子显微镜下观察肾小球足细胞形态。
1.4 统计学处理运用SPSS 16.0软件进行数据分析，数据用x±s表示，方差齐性数据运用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间的比较，用SNK检验进行两两比较，用Dunnett’s T3检验方差不具有齐性者。
2 结果 2.1 各组大鼠一般生化指标的比较8周末，与正常组比较，各组T2DM大鼠的血HbA1c、BG、BUN、USIR、UACR水平明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05);与T2DM组比较，MET组和GLY组上述指标明显降低(P < 0.05)，但高于NC组(P < 0.05)。MET组与GLY组之间BG和HbA1c值差异无统计学意义(P>0.05)，BUN、USIR和UACR差异有统计学意义(P < 0.05)。见Tab 1。
| Group | BG/mmol·L-1 | HbA1c/% | BUN/mmol·L-1 | USIR/μg·g-1 | UACR/mg·g-1 |
| NC | 4.45±1.07 | 4.13±0.89 | 6.91±2.52 | 11.83±1.25 | 0.25±0.66 |
| T2DM | 15.60±1.56* | 12.41±0.61* | 18.95±0.98* | 28.15±2.80* | 2.86±0.10* |
| MET | 11.75±0.98*# | 8.78±0.32*# | 11.30±2.02*# | 13.76±1.11*# | 1.80±0.08*# |
| GLY | 11.78±1.43*# | 8.85±1.07*# | 14.03±2.55* #△ | 15.43±1.15*#△ | 2.37±0.12* #△ |
| *P < 0.05 vs NC group; #P < 0.05 vs T2DM group; △P < 0.05 vs MET group | |||||
Fig 1、Tab 2免疫组化结果显示，NC组肾组织SIRT1表达最多，其余各组SIRT1IOD水平均减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。与T2DM组比较，MET组及GLY组SIRT1蛋白表达水平增加(P < 0.05)，MET组SIRT1蛋白表达高于GLY组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 1 Expression of SIRT1 in renal tissues of each group (×400) A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group |
| Group | GBMT/nm | SIRT1IOD | SIRT1 mRNA |
| NC | 137.96±18.51 | 94.90±19.30 | 1.03±0.04 |
| T2DM | 433.52±56.50* | 28.84±4.89* | 0.52±0.05* |
| MET | 255.58±27.15*# | 47.86±5.97*# | 0.88±0.06*# |
| GLY | 259.27±27.73*# | 38.09±6.10*#△ | 0.69±0.04*#△ |
| *P < 0.05 vs NC group; #P < 0.05 vs T2DM group; △P < 0.05 vs MET group | |||
Real-time PCR结果显示，NC组肾组织SIRT1 mRNA表达最多，其余各组SIRT1 mRNA水平均减少，且差异存在统计学意义(P < 0.05);MET组和GLY组肾组织SIRT1 mRNA表达明显高于T2DM组(P < 0.05)，且MET组SIRT1 mRNA表达高于GLY组，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Tab 2。
2.4 各组大鼠肾组织病理学变化Fig 2电镜下可见，NC组肾脏结构清晰，足突无融合，GBM厚薄均匀; T2DM组GBMT明显增厚，与NC组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，且足突融合，结构模糊不清; MET组和GLY组GBMT较T2DM组明显减低(P < 0.05)，足突融合明显改善; GLY组与MET组GBMT差异无统计学意义(P>0.05)。见Tab 2。
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| Fig 2 The pathological changes in kidneys of rats after 8 weeks of intervention observed under electron microscope (×10 000) A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group |
SIRT1是长寿蛋白(Surtuin)家族的一员[7]，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依赖性脱乙酰酶，在调节胰岛素信号和代谢率、控制胰岛素敏感性、脂肪储存代谢及葡萄糖利用等方面都起着高度保守的作用[8]。SIRT1参与许多细胞的代谢，并涉及人类疾病(如肥胖、T2DM、癌症、神经变性疾病)的发生发展[9]。Kume等[5]证实，在糖尿病状态下，代谢障碍可通过激活mTORC1的靶标以及减少AMPK和SIRT1活性而损害自噬作用。下调肾脏中SIRT1的表达可抑制自噬，导致线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积聚，参与糖尿病肾病的发生[7]。文献报道，SIRT1可能通过调节转录因子如p53的活性，保护肾小球足细胞[10]。Bao等[3]证实，激活线粒体AMPK-SIRT1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子α(peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1α, PGC-1α)信号通路，可缓解高脂饮食所致的糖尿病模型大鼠体内氧化应激和线粒体破坏，并增加肾脏肾病蛋白和足细胞标志蛋白的表达，SIRT1激活可阻止肾细胞凋亡，抑制炎症和纤维化[7]。
二甲双胍是一线抗糖尿病药物，Caton等[11]研究发现，二甲双胍可增加肝组织SIRT1蛋白表达和活性，抑制TORC2介导的糖异生。本动物实验结果显示，经二甲双胍及格列本脲干预8周后，MET组和GLY组BUN、UACR和GBMT均低于T2DM组，足细胞病理改变减轻，且MET组低于GLY组，但两组血糖和HbA1c无明显的差异，提示二甲双胍在降血糖作用相似的情况下，其肾脏保护作用较格列本脲更具优势, 部分独立于血糖的降低。进一步观察显示，糖尿病模型组大鼠肾组织SIRT1蛋白和mRNA表达明显降低，MET和GLY干预治疗后，可明显增加肾组织SIRT1表达，且二甲双胍优于格列本脲。提示二甲双胍可上调T2DM大鼠肾组织SIRT1蛋白和mRNA的表达，进而对肾脏提供一定的保护作用。MET增加肾组织SIRT1表达的机制尚不十分明确，可能与其抑制炎症反应、减轻氧化应激和诱导自噬有关。Tsuruoka等[12]发现，高血糖状态下足细胞SIRT1和PGC-1α的表达减少，导致线粒体损伤。二甲双胍激活AMPK/SIRT1旁路，减轻氧化应激，降低NAD+/NADH比值，从而增加SIRT1活性[11, 13]。此外，二甲双胍也可直接刺激SIRT1的表达和增加其活性，并通过调节SIRT1下游靶标叉头转录因子(Forkhead box O1，FoxO1)和p53/p21，保护内皮细胞[14]，激活SIRT1/ FoxO1通路，致线粒体氧化应激降低[15]。Zheng等[16]报道了视网膜内皮细胞在高血糖条件下，二甲双胍直接或部分通过肝激酶B1(liver kinase B1，LKB-1)/AMPK通路，增加SIRT1水平/活性，从而抑制ROS产生、NF-κB的激活以及Bax诱导的细胞凋亡。并且，二甲双胍治疗恢复SIRT1表达，可通过蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)独立的途径诱导自噬[17]。本研究结果显示，二甲双胍干预组尿SIRT1蛋白排泄明显降低，有待进一步观察。
综上所述，本实验初步结果显示二甲双胍可降低糖尿病大鼠肾组织SIRT1蛋白和mRNA的表达，该结果可能与其肾脏保护作用有关。
( 致谢: 本研究在安徽医科大学附属省立医院糖尿病研究室和病理科完成，在此致以由衷的感谢! )
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