经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)及溶栓治疗是目前急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)最重要的再灌注治疗方法。然而临床发现，AMI经溶栓或PCI治疗后，大于30%的患者可发生无复流现象，表现为心肌微循环水平血流受限，冠状动脉造影显示为冠状动脉血流明显减慢、心电图ST段回落不良以及临床持续性胸痛[1]。对无复流的防治尚无理想的标准治疗措施，近年来国内外陆续尝试了包括血栓保护装置和血栓抽吸装置等器械防治和西药干预的手段。但是，研究显示应用保护装置的患者并未获得血流和临床死亡率方面的益处[2]。同时，由于心肌组织无复流诸多病理因素，而这些西药均针对某个病理环节进行干预，因此疗效一般、作用有限。近年来陆续开展了中药防治无复流的实验研究和小样本临床观察[3-4]。但是，目前对中医药防治无复流的研究还非常有限。
双龙方(shuanglong formula, SLF)是李连达院士的临床经验方，由人参和丹参两味中药组成，方中丹参活血化瘀，人参补气养血，两者协同共奏益气活血之功效，主治冠心病心绞痛和心肌梗死，疗效肯定。20世纪80年代起，本课题组就开始对其进行组方、配伍和提取工艺的优化研究[5]，并通过大鼠和小型猪急性心肌缺血等实验证实，其对急性心肌缺血确有明显疗效[6-7]。从中医理论来分析，“心主血脉”，全身血脉的正常运行，全靠心气的推动，而再灌注后的无复流，是心肌微循环障碍的表现，应属心络受损，血瘀络阻。因此从理论上推测，具有益气活血功效的双龙方对无复流理应具有一定的防治作用。基于此，本项目拟就双龙方对大鼠心肌缺血/再灌注后无复流的影响及其机制进行探讨。
1 材料与方法 1.1 药物与试剂双龙保心片(薄膜衣片)，广州香雪制药有限公司，批号：20141002；氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)，批号2541C012，Amresco公司；水合氯醛，批号20110509，国药集团化学试剂有限公司；硫磺素S，美国Sigma公司，批号SLBG4212V；注射用六氟化硫微泡，Bracco Suisse SA公司，批号：16A039；大鼠血清肌钙蛋白(cardiac troponin T，cTnT)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA试剂盒，北京方程嘉鸿科技有限公司，批号：201706。
1.2 仪器DT-2000型电子天平，美国双杰兄弟有限公司；MPIDS-500多媒体彩色病理图像分析系统，北京空海公司；Vevo 770高分辨小动物超声影像系统，加拿大Visual sonics Inc；光学显微镜，德国Leica公司；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶标仪，芬兰Thermo公司；Thermo Scientific IEC CL31R离心机，美国Thermo公司。
1.3 实验动物与分组健康Wistar大鼠，♂，体质量200~220 g，200只，由斯贝福(北京)实验动物科技股份有限公司提供。许可证编号：SCXK京2016-0002。将200只大鼠随机分为5组，每组40只：模型组、假手术组、双龙方5g生药/kg组、双龙方2.5g生药/kg组、双龙方1.25g生药/kg组。
1.4 造模及给药各组大鼠在造模前按照10 mL·kg-1灌胃给药，每天1次，连续5 d，模型组和假手术组灌胃同体积蒸馏水。给药结束后，大鼠以10 mL·kg-1腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，仰卧固定于大鼠板上。在大鼠左侧第4、5肋间切口，打开胸腔，撕开心包，轻压胸廓挤出心脏，于左心耳下2 mm的冠状动脉左前降支下穿线，血管与结扎线之间垫一长约0.5~1 cm的软硅胶管，用0号手术线结扎冠脉，立即将心脏放回胸腔，以动脉夹夹闭切口，假手术动物只穿线不结扎。结扎后4 h，剪断硅胶管，实施再灌注。
1.5 指标测定再灌注4 h后，麻醉大鼠，测定如下指标。
1.5.1 心功能指标采用Vevo 770小动物高分辨率超声影像系统，选用RMV-716探头，在17.5 MHz的频率下，行超声心动图检查。受检大鼠于左侧胸骨旁获取左室乳头肌水平短轴切面，测量左心室舒张末期前壁厚度与后壁厚度、舒张末期和收缩末期左室内径，左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)和最大下降速率(dp/dtmin)，左心室收缩末期压和舒张末期压，计算舒张末期和收缩末期左室容积、射血分数、短轴缩短率(fractional shortening，FS)、每搏输出量(stroke volume，SV)。所有超声测值均取3个连续心动周期的平均值。
1.5.2 心肌声学造影按照每只0.8 mL的给药体积，在5 s内尾静脉匀速注射11.8 g·L-1声诺维注射液。将感兴趣区置于左心室前壁灌注异常区，从注射造影剂前5 s开始记录造影剂在心肌灌注的视频(共16 s)，使用ACQ软件，得到造影显像的时间-强度曲线及其拟合函数：Y=A(1-e-βt)+C。读出微血管密度(A，dB)，局部血流速度(β，s-1)，计算局部心肌灌注量(A·β)。
1.5.3 血液学指标超声检查结束后，于股动脉注射6%硫磺素S 1 mL·kg-1，1 min后，于腹主动脉取血，分离血清。按照试剂盒说明书，测定血清cTnT、CRP、CK、LDH水平。
1.5.4 心肌无复流面积大鼠取血完毕后，立即处死，取出心脏，用生理盐水冲洗心腔残留的血液，用滤纸吸干多余液体后称重；自结扎线下平行冠状动脉沟均匀地将心室部分切成等厚5片，分别称重后，将心脏切片置于薄层色谱仪的暗箱中，于365 nm波长光源下，观察荧光，数码相机拍照，分别获得5片心肌的正、反面图像，用多媒体彩色病理图像分析系统测量每片心肌双侧的无复流区(硫磺素不着色，呈暗黑色)和复流区(硫磺素着色，呈明亮的蓝绿色)，计算无复流区占心室面积百分比(AN/V)和无复流区占全心面积百分比(AN/WH)。
1.5.5 心肌梗死面积上述处理结束后，将心脏切片置于0.2%硝基四氮唑蓝染液(N-BT)中，常温避光染色2~3 min；用扫描仪分别扫描5片心肌的正、反面，获得扫描图像，用多媒体彩色病理图像分析系统测量每片心肌双侧的梗死区(N-BT非染色区，呈灰白色)和非梗死区(N-BT染色区，呈蓝黑色)面积，计算梗塞区面积占心室面积百分比(AI/V)和梗塞区面积占全心面积百分比(AI/WH)。
1.6 统计学分析数据用x±s表示。各组之间的比较采用单因素方差分析，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验。
2 结果 2.1 双龙方对心肌无复流面积和心梗面积的影响Fig 1、2及Tab 1结果显示，与模型组比较，双龙方高、中剂量组的心肌无复流面积和梗死面积均明显减小(P < 0.01或P < 0.05)，双龙方低剂量组的心肌无复流面积和梗死面积有减小趋势。
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| Fig 1 Effects of Shuanglong formula on myocardial infarct area in I/R rats A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1 group; D: SLF 2.5 g·kg-1 group; E: SLF 1.25 g·kg-1 group |
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| Fig 2 Effects of Shuanglong formula on no-reflow area in I/R rats A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1 group; D: SLF 2.5 g·kg-1 group; E: SLF 1.25 g·kg-1 group |
| Group | n | No-reflow area | Myocardial infarct area | ||
| AN/V/% | AN/WH/% | AI/V/% | AI/WH/% | ||
| Sham | 10 | - | - | - | - |
| I/R | 8 | 38.21±7.35 | 22.33±5.18 | 61.94±21.15 | 38.46±14.14 |
| SLF 5 g·kg-1 | 10 | 15.68±8.33** | 10.46±5.15** | 15.89±3.85** | 10.53±2.58* |
| SLF 2.5 g·kg-1 | 9 | 22.14±7.27** | 13.18±4.34* | 25.39±10.61* | 16.36±7.63* |
| SLF 1.25 g·kg-1 | 10 | 27.43±7.00 | 16.87±4.28 | 51.05±29.27 | 33.97±20.44 |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs I/R | |||||
Fig 3、Tab 2心脏B超结果显示，与模型组比较，双龙方高、中剂量组前壁厚度明显增加，收缩末期左心室内径和容积明显降低，短轴缩短率、射血分数和每搏输出量明显提高(P < 0.01或P < 0.05)；双龙方低剂量组前壁厚度、射血分数明显增加(P < 0.01或P < 0.05)，后壁厚度、短轴缩短率、每搏输出量有增加趋势，左心室内径和容积有降低趋势。
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| Fig 3 Effect of Shuanglong formula on cardiac function evaluated by echocardiography A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1 group; D: SLF 2.5 g·kg-1 group; E: SLF 1.25 g·kg-1 group |
| Group | n | LVAW d/mm | LVAW s/mm | LVPW d/mm | LVPW s/mm | LVID d/mm | LVID s/mm | LVV d/μL | LVV s/μL | EF/% | FS/% | SV/μL |
| Sham | 10 | 1.86±0.04** | 2.83±0.06** | 2.02±0.28 | 2.55±0.44 | 5.82±0.50** | 3.14±0.66** | 169.29±35.77** | 42.01±19.53** | 75.85±8.47** | 46.28±8.36** | 127.27±22.68** |
| I/R | 8 | 1.44±0.08 | 1.61±0.07 | 1.83±0.05 | 2.26±0.17 | 7.20±0.52 | 6.08±0.45 | 273.76±42.81 | 186.53±28.96 | 28.93±8.81 | 15.52±3.69 | 87.22±25.78 |
| SLF 5 g·kg-1 | 10 | 1.86±0.04** | 2.07±0.23** | 2.17±0.48 | 2.50±0.46 | 6.63±0.95 | 4.49±0.67** | 228.34±71.14 | 95.25±33.62** | 55.58±16.63** | 30.8±11.64** | 133.10±73.84 |
| SLF 2.5 g·kg-1 | 9 | 1.88±0.03** | 1.95±0.18** | 1.92±0.14 | 2.40±0.27 | 6.83±0.43 | 4.77±0.48** | 242.52±35.72 | 107.53±25.17** | 54.87±12.35** | 29.93±8.41** | 134.99±45.33* |
| SLF 1.25 g·kg-1 | 10 | 1.76±0.11** | 1.77±0.14* | 1.92±0.15 | 2.36±0.15 | 7.07±0.41 | 5.76±0.59 | 262.39±34.56 | 166.66±36.45 | 36.81±9.26** | 18.54±5.38 | 95.73±21.23 |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs I/R | ||||||||||||
Fig 4、Tab 3心肌声学造影结果显示，与模型组比较，双龙方高、中、低剂量组左心室前壁心肌组织的微血管密度、局部心肌灌注量、峰值视频强度PI值明显增加(P < 0.01或P < 0.05)；双龙方高剂量组局部血流速度明显增加(P < 0.01)；双龙方中、低剂量组局部血流速度有增加趋势。
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| Fig 4 Effect of Shuanglong formula on regional myocardial blood flow A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1 group; D: SLF 2.5 g·kg-1 group; E: SLF 1.25 g·kg-1 group |
| Group | n | A/dB | β/s-1 | PI/dB | TTP/ms | Aβ/dB s-1 |
| Sham | 10 | 201.64±82.45** | 0.37±0.22* | 907.10±240.05** | 5429.18±3098.83 | 63.12±27.19** |
| I/R | 8 | 103.04±12.98 | 0.19±0.06 | 459.41±93.27 | 7304.70±731.02 | 18.98±5.64 |
| SLF 5 g·kg-1 | 10 | 194.10±75.51** | 0.32±0.15* | 755.62±351.13* | 6734.94±2144.34 | 56.58±30.41** |
| SLF 2.5 g·kg-1 | 9 | 191.83±75.01** | 0.26±0.14 | 692.74±171.19** | 8013.97±2140.59 | 42.92±20.25** |
| SLF 1.25 g·kg-1 | 10 | 164.27±45.72** | 0.23±0.09 | 677.55±229.66** | 7779.14±1633.83 | 35.82±14.69** |
| **P < 0.01，*P < 0.05 vs I/R | ||||||
Tab 4结果显示，与模型组比较，各组心肌损伤相关的血液学指标未见明显改善，血清cTnT、CRP、CK、LDH水平未见明显变化。
| Group | n | CK/U·L-1 | LDH/U·L-1 | cTnT/μg·L-1 | CRP/ng·L-1 |
| Sham | 10 | 43.45±15.68 | 4.73±1.17 | 822.57±198.68 | 156.93±36.88 |
| I/R | 8 | 48.63±14.58 | 4.82±1.18 | 1061.39±485.17 | 157.18±34.88 |
| SLF 5 g·kg-1 | 10 | 51.15±13.05 | 4.85±1.12 | 1210.52±253.31 | 165.18±27.23 |
| SLF 2.5 g·kg-1 | 9 | 45.73±16.71 | 4.43±1.17 | 984.21±390.63 | 175.19±44.20 |
| SLF 1.25 g·kg-1 | 10 | 50.52±18.94 | 4.56±0.86 | 891.11±227.57 | 170.23±41.05 |
近年来，国内有学者就中医药防治无复流进行了一些研究，但是研究内容和深度非常有限。本课题组采用李连达院士经验方双龙方对大鼠心肌缺血/再灌注后无复流的影响及其机制进行研究。研究显示，双龙方可以明显减小心肌无复流面积和梗死面积；明显改善心功能指标，明显增加左心室前壁缺血区厚度，明显降低收缩末期左心室内径和容积，明显提高短轴缩短率、射血分数和每搏输出量；明显增加左心室前壁心肌组织的微血管密度、血流速和血液灌注量；心肌酶学指标，模型组有升高趋势，双龙方干预组有降低趋势，但是差异均无统计学意义，可能与实验样本量较小、检测过程存在误差有关。
现代药理研究表明，双龙方中的两味药——丹参和人参均具有较强的心血管活性。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾草属多年生草本植物的干燥根及根茎，性苦微寒，有活血化瘀、养心除烦之功效。其心血管活性作用包括：①阻滞钙通道[8]，扩张冠状动脉，增加冠脉流量；②改善心肌能量代谢，降低心肌能量消耗而不损伤心肌；③改善外周血液循环、加快微循环血液流通、增加毛细血管网；④降低血液黏度，抑制血小板的激活、聚集性和黏附性，抑制血栓形成[9-10]；⑤清除氧自由基[11]，提高机体耐缺氧能力、保护心肌细胞。人参是五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根，最早记载于《神农本草经》，有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智之效。其心血管系统的作用主要表现为：①保护心功能，抑制急性心肌梗死导致的心室重构、改善心功能[12]；②改善微循环[13]，扩张微血管管径、增加微血管血流速度和微血管交叉网点数目；③抗自由基，对抗心肌细胞缺氧性损伤[14]；④改善血液黏稠度、促进急性心肌梗死后的心肌血管再生[15]。此外，人参还能提高机体的抗应激能力，增强机体对疾病的抵抗力和耐受性。由上可知，无论从双龙方“益气活血”的配伍理论分析，还是从其所含两味药的现代药理活性，双龙方对无复流都具有一定防治作用，与本项目研究结果一致。
本项目研究显示双龙方可以有效防治心肌缺血/再灌注后的无复流现象，为临床上中医药防治无复流提供了可行性思路和科学依据。
( 致谢: 本文实验是在首都医科大学基础科研楼机能实验室进行的，非常感谢许晴老师的指导和帮助！)
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