2. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明 650118
2. Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College, Institute of Medical Biology, Yunnan Key Lab of Major Infectious Diseases Vaccine Development, Kunming 650118, China
甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一种依赖性极高的新型合成毒品，具有精神依赖性强、复吸率高、神经毒性大等特点, 长期滥用具有很强的神经毒性和药物依赖性。METH的神经毒性主要与中枢神经系统的多巴胺能信号通路相关，影响多巴胺的释放而导致神经退行性损伤[1]。SH-SY5Y细胞即人神经母细胞瘤细胞，是一种与人类多巴胺能神经细胞具有相似生化特征的细胞株，被广泛用于中枢神经系统神经毒性的研究[2]。目前METH滥用趋势严重，已成为当今全球最严重的公共卫生问题之一。研究表明，自噬参与了METH神经毒性的发生、发展，但自噬在METH神经毒性及其依赖机制中的作用目前尚未完全阐明。
随着METH依赖机制和戒断干预研究的不断深入，寻找戒毒药物逐渐受到重视。天麻素(gastrodin)是天然中药天麻的主要化学成分，是天麻活性成分中含量最高的有效单体成分，其具有镇静催眠、抗癫痫、镇痛、抗氧化、抗炎、增强机体免疫力等作用。此外，研究表明，天麻素具有抗自由基和保护细胞膜、抗氧化、凋亡、抑制能量代谢、减少细胞脂肪蓄积以及对多种因素导致的神经元损伤具有保护作用等[3-6]。因此，本研究拟证实METH可诱导SY5Y细胞自噬，并用天麻素进行干预，观察天麻素在METH诱导SY5Y细胞自噬中的作用，并初步探讨其作用机制。
1 材料 1.1 细胞SH-SY5Y细胞株购自国家实验细胞资源共享平台。
1.2 试剂METH试剂购自中国药品生物制品检定所；天麻素购自成都思曼特生物科技有限公司；DEME:F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)；LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt抗体(Abcam公司)；β-actin抗体(Sigma公司)；山羊抗兔和抗鼠二抗(CST公司)；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot相关试剂(碧云天生物技术研究所)。
1.3 仪器超净工作台(苏州净化公司产品)；CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher公司); 倒置显微镜(Nikon)；CT15RE台式微量高速离心机(Hitachi公司)；Synergy HT酶标仪(美国Bio-Tek公司)；164-5050型Western电泳仪、GelDoc2000型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；激光共聚焦显微镜(德国徕卡)。
2 方法 2.1 试剂配制取20 mg METH(分子质量185.7)，加2 mL PBS溶解，过滤除菌，配制成浓度为53.85 mmol·L-1，4℃冰箱保存。取20 mg天麻素(分子质量为286.28)，溶于2 mL PBS中，配制成浓度为83.02 mmol·L-1，4℃冰箱保存。
2.2 细胞培养SH-SY5Y细胞用含15%胎牛血清、1%双抗的DMEM:F12培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每36 h换液1次，待细胞长满培养板后，通过胰酶消化液消化并进行传代培养，当培养细胞达到一定数量，且呈现对数生长时待用。根据实验方案设计加入不同浓度的METH和天麻素。
2.3 细胞药物处理及干预贴壁细胞经胰酶消化制备成单细胞悬液，以4×105~5×105/孔的密度接种于6孔板中，培养36 h后，用METH(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mmol·L-1)处理细胞。通过检测自噬相关蛋白并结合细胞形态学改变，本研究选择METH诱导自噬的浓度是2.0 mmol·L-1，提前1 h给予1 mmol·L-1天麻素干预，随后在显微镜下观察细胞形态学变化，并检测给药前后LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt和p-Akt的变化情况。
2.4 免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜分析对数生长的细胞经胰酶消化后，接种于铺有小玻片的24孔板内，当细胞密度达70%~80%时加药，24 h后弃掉每孔内的培养液，用PBS小心漂洗细胞2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定20 min，漂洗细胞5 min×3次；0.5% Triton-X100穿孔30 min, 漂洗细胞5min×3次；5%山羊血清封闭液封闭30 min，漂洗细胞5 min×3次；加入一抗(1 :200), 4 ℃过夜。漂洗细胞5 min×3次，加入1% BSA稀释的二抗(1 :200)，于37℃杂交1 h，漂洗细胞5 min×3次，5 mg·L-1 DAPI染色2 min，漂洗细胞5 min×3次，在载玻片上滴1滴抗淬灭剂，随后将小玻片倒扣在载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察结果。
2.5 Western blot分析弃掉每孔内的培养液，用PBS漂洗细胞2次，6孔细胞培养板中每孔加入100 μL裂解液，于冰上裂解10~20 min后，用细胞刮收集蛋白并移至离心管，于4℃、14 000 r·min-1离心10 min，取上清分装，用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白混合5×蛋白上样缓冲液，在沸水浴中煮10 min进行蛋白变性。SDS-PAGE电泳，半干电转移法将蛋白转至PVDF膜。用5%的脱脂奶粉封闭1 h，滴加一抗(1:1 000)，4℃过夜，TBST洗膜10 min×4次，滴加二抗(1:5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，用ECL显色液激发化学发光，曝光，β-actin作为内参。应用Image J软件对Western blot条带进行灰度值比较。
2.6 统计学分析实验数据均以x±s表示，并应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，组间的比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 METH处理24 h后细胞形态学变化如Fig 1所示，随着METH浓度的增加，SY5Y细胞胞体逐渐萎缩变圆，突起逐渐变短、消失，同时部分细胞质内可见大小不等的散在性空泡结构形成。当METH浓度达3 mmol·L-1时，可见SY5Y细胞失去原形，不贴壁，呈漂浮状态。天麻素干预后，细胞折光性增强，胞质内空泡结构减少，部分细胞形态发生变化。
|
| Fig 1 Morphological changes of SY5Y cells by METH and gastrodin treatment for 24 h A: Control; B: 0.5 mmol·L-1 METH; C: 1.0 mmol·L-1 METH; D: 1.5 mmol·L-1 METH; E: 2.0 mmol·L-1 METH; F: 2.5 mmol·L-1 METH; G: 3.0 mmol·L-1 METH; H: 1 mmol·L-1 Gastrodin; I: 1 mmol·L-1 Gastrodin+2.0 mmol·L-1 METH |
如Fig 2所示，与对照组相比，SY5Y细胞LC3-Ⅱ表达水平随着METH浓度的增加逐渐增强，Beclin-1表达水平升高(P < 0.05，P < 0.01)。提示METH可诱导SY5Y细胞自噬。
|
| Fig 2 Effect of METH on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells detected by Western blot *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 3所示，在不同时间点(6~48 h)给予2 mmol·L-1 METH处理SY5Y细胞，24 h后LC3Ⅱ和Beclin-1水平升高最明显。
|
| Fig 3 Effect of METH on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells at different time points detected by Western blot The levels of LC3-Ⅱ and Beclin-1 increased time-dependently with a significant rise at 24h.This time point was used in all subsequent experiments. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 6 h. |
Fig 4结果显示，天麻素+METH组LC3-Ⅱ的表达水平比METH组有所降低。与对照组相比，METH组LC3-Ⅱ和Beclin1表达水平明显增强(P < 0.01)；与METH组相比，给予天麻素干预后，LC3-Ⅱ和Beclin1表达水平降低(P < 0.05, P < 0.01)，说明天麻素对METH诱导的SY5Y细胞自噬有抑制作用。
|
| Fig 4 Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells detected by Western blot (A) and confocal microscope (B) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs METH group |
如Fig 5、6所示，METH处理SY5Y细胞24 h后，与对照组相比，mTOR和Akt表达差异无显著性，p-mTOR、p-Akt表达水平明显降低(P < 0.01)，说明METH诱导SY5Y细胞自噬与其减弱p-mTOR和p-Akt的表达水平有关。与METH组相比，天麻素干预后，mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达水平升高(P < 0.05, P < 0.01)。说明天麻素通过增强Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制METH诱导SY5Y细胞自噬的作用。
|
| Fig 5 Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of Akt(A) and p-Akt(B) in SY5Y cells detected by Western blot *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs METH group |
|
| Fig 6 Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of mTOR and p-mTOR in SY5Y cells detected by Western blot *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs METH group |
自噬对细胞内异常蛋白质的降解和细胞器的更新具有十分重要作用，能够提高细胞对周围环境的适应性，对于抗肿瘤治疗以及维持营养缺乏状态下细胞的代谢功能不可或缺[7]。但是过度自噬却是细胞程序性死亡的一种方式[8]。在中枢神经系统中，自噬是把双刃剑，自噬功能的紊乱使神经元对兴奋性毒性更加敏感[9]。近年来研究表明，自噬参与了METH神经毒性作用，METH与自噬的研究虽然已取得一定的进展，但METH滥用与自噬之间确切的作用机制和信号通路仍不清楚。
本研究发现，随着METH浓度的增加，SY5Y细胞胞体逐渐萎缩变圆，突起逐渐变短、消失，同时部分细胞质内可见大小不等的散在性空泡形成。当METH浓度达3 mmol·L-1时，细胞失去原形，不贴壁呈漂浮状态。说明METH对SY5Y细胞具有一定的毒性作用，同时可诱导细胞质内大量类似自噬泡结构的形成。2 mmol·L-1 METH处理SY5Y细胞24 h后，与对照组相比，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显增强，说明METH可诱导SY5Y细胞自噬，且METH处理24 h后自噬发生最明显。研究表明，METH可明显诱导神经细胞自噬，METH滥用可使机体产生大量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，并破坏线粒体功能，从而诱导细胞死亡。同时，线粒体功能障碍可增加患神经退行性疾病的风险[10]。
随着METH滥用的严重性和影响性，药物戒毒治疗的研究逐渐受到重视。针对METH神经毒性治疗方面，研究表明，褪黑素、牛磺酸及N-乙酰半胱氨酸(NAC)等抗氧化药物对METH诱导的神经毒性和自噬具有保护作用[11]。本研究选择云南天然药物天麻素，探讨天麻素在甲基苯丙胺诱导SY5Y细胞自噬中的作用及其作用机制。本研究发现，天麻素干预后，细胞折光性增强，部分细胞形态发生变化，胞质内空泡结构减少。给予2 mmol·L-1 METH处理前1 h加入1 mmol·L-1天麻素，与对照组相比，天麻素组表达LC3-Ⅱ差异无显著性，Beclin-1表达水平稍升高。与METH组相比，天麻素+METH组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平均明显降低，说明天麻素可减弱METH诱导的SY5Y细胞自噬，对METH诱导的SY5Y细胞自噬有一定的抑制作用。
mTOR是调节自噬的负调控因子，当机体处于饥饿状态和产生大量ROS时，mTOR的活性被抑制而激发自噬。研究表明，ERK、JNK、p38 MAPK信号通路和Beclin1/Bcl-2复合物、Beclin1-ClassⅢPI3K等参与了自噬的调节[12-14]。PI3K-Akt-mTOR信号通路是调节自噬的经典信号通路，被证实参与了阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)与帕金森病(Parkinson’s disease，PD)动物模型的发病过程[15]。PI3K-Akt能够调节下游mTOR活性，mTOR为自噬的重要调节蛋白[16]。研究表明，天麻素能够通过抑制LPS诱导的星形胶质细胞过度自噬，发挥保护作用，其保护作用与天麻素调控凋亡相关的Bcl-2、Bax表达及自噬相关的PI3K-Akt-mTOR、p38 MAPK信号通路密切相关[9]。因此，本研究检测了天麻素干预前后Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达情况。结果发现，2 mmol·L-1 METH处理SY5Y细胞24 h后，与对照组相比，p-mTOR和p-Akt表达水平明显降低，然而，mTOR和Akt表达无明显差异，说明METH诱导SY5Y细胞自噬与其减弱p-mTOR和p-Akt的表达水平有关。提前1 h给予1 mmol·L-1天麻素干预后，与METH组相比，天麻素+METH组Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达水平均升高, 说明天麻素通过增强Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达水平，发挥抑制METH诱导SY5Y细胞自噬的作用。
由于METH神经毒性戒断药物的研究目前尚处于起步阶段，本实验通过研究天麻素在METH诱导SY5Y细胞自噬中的作用及机制，揭示了天麻素对METH诱导的SY5Y细胞自噬具有一定的抑制作用，其机制与天麻素调控Akt和mTOR信号通路密切相关。本研究可为METH滥用者提供治疗的新策略，同时也为中药的研发奠定基础。
( 致谢: 本实验是在中国医学科学研究院生物研究所实验动物中心和昆明医科大学法医学院实验室完成的，对为本实验辛勤付出的老师和同学表示衷心的感谢。)
| [1] | Li X, Wang H, Qiu P, et al. Proteomic profiling of proteins associaated with methamphetamine-induced neurotoxicity in different regions of rat brain[J]. Neurochem Int, 2008, 52(1-2): 256-64. doi:10.1016/j.neuint.2007.06.014 |
| [2] | Rabelo T K, Zeidan-chulia F, Vasques L M, et al. Redox characterization of usnic acid and its cytotoxic effect on hunman neuron-like cells(SH-SY5Y)[J]. Toxicol In Vitro, 2012, 26(2): 304-14. doi:10.1016/j.tiv.2011.12.003 |
| [3] | 陈维红, 罗栋. 天麻素、天麻多糖药理作用研究进展[J]. 中国药物评价, 2013, 30(3): 132-4, 141. Chen W H, Luo D. Research development on pharmacological action in Gastrodia elata blume and Gastrodia elata polysaccharide[J]. Chin J Drug Eval, 2013, 30(3): 132-4, 141. |
| [4] | 耿雅娜, 于滨, 孔维佳. 天麻素通过激活AMPK通路减少油酸诱导的HL-7702细胞脂肪蓄积[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(1): 39-44. Geng Y N, Yu B, Kong W J. Gastrodin ameliorates oleic acid-induced fat accumulation through activation of AMPK pathway in HL-7702 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(1): 39-44. |
| [5] | 赵燕玲, 张博爱, 贾延劼, 等. 天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2009, 12(5): 33-6. Zhao Y L, Zhang B A, Jia Y J, et al. Protective effects of gastrodine on injured rat cerebral neurons by KA[J]. Chin J Pract Nervous Dis, 2009, 12(5): 33-6. |
| [6] | 李海龙, 栗艳, 厚荣荣, 等. 天麻素对百草枯和代森锰诱导的小鼠脑黑质多巴胺能神经元损伤作用[J]. 成都中医药大学学报, 2010, 33(1): 57-9. Li H L, Shu Y, Hou R R, et al. Neuroprotective effects of gastrodin on PQ and MB induced dopaminergic neurons damage in C57BL mice[J]. J Chengdu Univ TCM, 2010, 33(1): 57-9. |
| [7] | Meijer A J, Codogno P. Autophagy: regulation and role in disease[J]. Crit Rev Clin Lab Sci, 2009, 46(4): 210-40. doi:10.1080/10408360903044068 |
| [8] | Button R W, Luo S, Rubinsztein D C. Autophagic activity in neuronal cell death[J]. Neurosci Bull, 2015, 31(4): 382-94. doi:10.1007/s12264-015-1528-y |
| [9] | Wang X S, Tian Z, Zhang N, et al. Protective effects of gastrodin against autophagy-mediated astrocyte death[J]. Phytother Res, 2016, 30: 386-96. doi:10.1002/ptr.v30.3 |
| [10] | Van L S, Berman S B. Mitochondrial dynamics in Parkinson's disease[J]. Exp Neurol, 2009, 218: 247-56. doi:10.1016/j.expneurol.2009.03.019 |
| [11] | 杨根梦, 陈逊, 曾晓锋. 甲基苯丙胺诱导神经细胞自噬的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(10): 1341-4. Yang G M, Chen X, Zeng X F. Research progress of methamphetamine inducing nerve cell's autophagy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(10): 1341-4. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.003 |
| [12] | Pattingre S, Tassa A, Qu X, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy[J]. Cell Death Differ, 2005, 122: 927-39. |
| [13] | Chu C T, Zhu J, Dagda R. Beclin 1-independent pathway of damage-induced mitophagy and autophagic stress: implications for neurodegeneration and cell death[J]. Autophagy, 2007, 3: 663-6. doi:10.4161/auto.4625 |
| [14] | Tang G, Yue Z, Talloczy Z, et al. Autophagy induced by Alexander disease-mutant GFAP accumulation is regulated by p38/MAPK and m TOR signaling pathways[J]. Hum Mol Genet, 2008, 17(11): 1540-55. doi:10.1093/hmg/ddn042 |
| [15] | Heras-Sandoval D, Pérez-Rojas J M, Hernández-Damián J, et al. The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration[J]. Cell Signal, 2014, 26(12): 2694-701. doi:10.1016/j.cellsig.2014.08.019 |
| [16] | Hu Z P, Yang B B, Mo X Y, et al. Mechanism and regulation of autophagy and its role in neuronal diseases[J]. Mol Neurobiol, 2015, 52(3): 1190-209. doi:10.1007/s12035-014-8921-4 |