2. 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心;
3. 中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南 大理 671000;
4. 四川好医生药业集团，四川 成都 610000
2. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics, Dali Yunnan 671000, China;
3. Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali Yunnan 671000, China;
4. Good Doctor Pharmaceutical Group, Chengdu 610000, China
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)属炎症性肠病之一，临床表现为腹痛腹泻、里急后重、黏液脓血便等，其发病机制尚未明了[1]。目前，临床上治疗UC主要以水杨酸制剂和糖皮质激素为主，代表药物有美沙拉嗪和柳氮磺胺吡啶等，但是毒副作用较大，无法长期用于治疗。研究表明，免疫失衡在UC发病过程中起重要作用，过度活化的效应细胞产生的抗体、细胞因子、炎症介质等引起组织破坏和炎性病变[2]。2, 4, 6-三硝基苯磺酸(2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)是一种半抗原物质，能与动物肠道黏膜组织中的蛋白质结合形成完全抗原，导致肠道免疫反应及炎症的发生。近年来研究发现，美洲大蠊(Periplaneta americana)在调节机体免疫力、修复肠道黏膜损伤、抗炎镇痛[3]等方面有明显的作用，且以美洲大蠊研制的康复新液，在临床上采用保留灌肠治疗UC已取得了明显的疗效，也有研究探索了康复新液治疗Th2型UC的可能机制[4]。本实验用TNBS诱导SD大鼠UC模型，考察康复新液的疗效及作用机制，为康复新液用于UC临床治疗提供实验依据。
1 材料 1.1 实验动物健康SPF级♂ SD大鼠(200±10)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验单位使用许可证编号：SYXK(滇)-2011-0004，许可证号：SCXK(湘)-2011-003。
1.2 药物与试剂TNBS，Sigma公司，批号：SLBP0889V；康复新液，四川好医生攀西药业有限责任公司，批号：160519；柳氮磺吡啶(SASP)肠溶片，上海信宜天平药业有限公司，批号：H31020557；大鼠白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)ELISA试剂盒，欣博盛生物科技有限公司，批号：R150929-002a；隐血试剂盒、大鼠白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)试剂盒、转化生长因子-1(transforming growth factor-1，TGF-β1)试剂盒，南京建成生物工程研究所；生理盐水(NS)，贵州天地药业有限责任公司；水合氯醛，上海国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醛溶液，天津市福晨化学试剂厂。
1.3 仪器2010酶标仪，奥地利安图斯公司；BI-2000医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司；AL204-IC型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；HWS24恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；HC-3018R高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；先行者CP214电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司。
1.4 受试药的配制将康复新液用冷冻干燥机干燥成黏稠状浸膏，用生理盐水配制成浓度分别为167、83.5、41.75 g·L-1的高、中、低剂量溶液，按大鼠体重15 mL·kg-1给药。
2 方法 2.1 动物模型的制备取60只♂ SD大鼠，根据Morris等[5]描述的方法，复制TNBS诱导的UC模型。大鼠禁食不禁水24 h，用10 g·L-1水合氯醛溶液按3.0 mL·kg-1麻醉大鼠，用直径2 mm的聚乙烯管于直肠内约8 cm处，按75 mg·kg-1灌入TNBS-乙醇溶液(乙醇终体积分数为0.3)，注入后，大鼠倒置使溶液保留10 s，待清醒后正常喂养。另取10只大鼠作为正常组(normal)，采取与模型复制相同操作，但灌肠用生理盐水。
2.2 动物分组、给药及DAI评分造模后d 7(以造模当日为d 0计)，参考Hamamoto等[6]标准，将大鼠进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分(以0~3分为极轻度炎症、4~6分轻度炎症、7~9分为中度炎症、10~12分为重度炎症)，按炎症严重程度分层随机分为模型组(model，NS)，SASP组(0.3 g·kg-1)和康复新液高、中、低剂量组(KFX 2.50、1.25、0.62 g·kg-1)。分组次日(d 8)开始给药，除正常组和模型组给予生理盐水灌肠，其余各药物组给予相应的药物灌肠，每天1次，连续给药14 d，于造模后d 1、4、7、10、14、21进行DAI评分。
2.3 血清IL-4、IL-17含量的检测末次给药后次日(d 22)，用质量分数为10 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，4℃静置凝固后，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，用试剂盒检测IL-4、IL-17含量。
2.4 脏器指数、结肠长宽及CMDI的测定解剖取胸腺、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器，称量质量，计算脏器指数(脏器指数=各脏器质量/体质量×100%)。沿肠系膜缘剪开肠腔，生理盐水冲洗粪便，观察肠壁，称量湿质量。采集结肠照片，参照标准[7]进行结肠黏膜损伤指数(colonmucosa damage index，CMDI)评分。
2.5 结肠组织MPO、EGF和TGF-β1含量的检测切取病变严重区域结肠组织0.15 g，按1 :9(W/V)生理盐水匀浆，3 500 r·min-1离心10 min，取上清液，用试剂盒检测上清液中MPO、EGF、TGF-β1的含量。
2.6 结肠组织HS评分剩余结肠用40 g·L-1甲醛固定，制作病理切片，并参照标准[8]进行病理组织学(histopathological score，HS)评分。
2.7 统计学处理实验数据均以x±s表示，采用统计软件SPSS 17.0进行检验，符合正态分布的数据采用方差分析，不符合正态分布的数据，采用秩和检验。
3 结果 3.1 康复新液对UC大鼠DAI评分的影响实验期间，正常组大鼠反应灵活，进食正常，无腹泻及血便，大便呈球形或条形，未出现异常情况。其余大鼠自造模后d 1均出现不同程度的厌食、懒动、体重下降、大便隐血或血便。d 7进行分组后的各组大鼠DAI评分组间差异无统计学意义，说明各造模组大鼠炎症程度具有一致性，而与正常组比较差异均有显著性(P＜0.01)。给药前期，模型组大鼠(生理盐水灌肠)血便、腹泻加重，体重下降明显，后期有所缓解，粪便逐渐转为松散，并且体重有回升的趋势。末次给药结束后(d 21)，模型组大鼠DAI评分仍明显高于正常组(P＜0.01)，经SASP和康复新液治疗的大鼠症状恢复较快，SASP组和康复新液各剂量组DAI评分明显低于模型对照组(P＜0.01)。不同时间点大鼠的DAI分值见Tab 1。
| Group | Dose/g·kg-1 | DAI score | |||||
| d 1 | d 4 | d 7 | d 10 | d 14 | d 21 | ||
| Normal | - | 1.5±0.52 | 2.00±0.82 | 1.80±0.79 | 1.30±1.06 | 1.70±0.48 | 1.40±0.84 |
| Model | - | 9.0±0.52** | 7.70±1.49** | 6.50±2.07** | 4.50±2.07** | 5.10±1.66** | 4.80±1.23** |
| SASP | 0.30 | 8.9±0.33** | 7.80±1.81** | 6.90±1.20** | 2.90±1.37 | 2.80±1.40## | 1.90±0.74## |
| KFX | 0.625 | 9.1±0.32** | 7.50±1.12** | 5.30±2.67** | 3.50±1.37** | 3.00±2.21## | 2.70±0.82*## |
| 1.25 | 9.0±0.63** | 7.20±1.93** | 6.20±2.78** | 3.90±1.91** | 4.30±1.83**△ | 2.40±0.84## | |
| 2.50 | 9.0±0.52** | 7.00±1.76** | 6.00±1.89** | 3.00±1.83 | 2.60±1.71## | 2.20±0.79## | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal; ##P < 0.01 vs model; ΔP < 0.05 vs SASP | |||||||
末次给药次日(造模后d 22)，正常组、模型组与各给药组在肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数上并无显著性差异。正常组大鼠肉眼观察结肠黏膜无明显水肿、糜烂和溃疡形成。模型组大鼠肠壁可见明显的充血和水肿，结肠明显缩短(P＜0.05或P＜0.01)；沿肠系膜纵向剖开可见肠壁黏膜有散在的溃疡点和糜烂，病变主要累及远端结肠，CMDI评分升高(P＜0.01)。SASP组和康复新液各剂量组大鼠肠黏膜病变较模型对照组明显好转，结肠指数均明显降低(P＜0.01)。见Tab 2。
| Group | Dose/g·kg-1 | Colon index/mg·g-1 | Length of colon/cm | Colon aspect ratio | CMDI |
| Normal | - | 3.55±0.39 | 19.74±1.05 | 25.62±3.49 | 0.60±0.52 |
| Model | - | 6.24±0.81** | 16.80±1.35** | 18.62±3.84** | 3.10±0.74** |
| SASP | 0.30 | 4.65±0.72**## | 18.55±1.60*## | 22.61±1.96# | 2.00±0.67**# |
| KFX | 0.625 | 4.94±0.42**## | 17.56±1.51** | 19.56±1.64** | 2.20±0.63** |
| 1.25 | 4.91±0.53**## | 18.03±0.94** | 20.16±1.40** | 2.20±0.42** | |
| 2.50 | 4.82±0.43**## | 18.28±1.08*# | 21.44±1.53* | 2.00±0.82**# | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | |||||
如Fig 1所示，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4含量明显降低(P＜0.01)、IL-17含量明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，SASP组和康复新液各剂量组大鼠血清IL-4含量均不同程度升高(P＜0.05或P＜0.01)，而康复新液高剂量组IL-17含量明显降低(P＜0.05)。
|
| Fig 1 Changes of serum levels of IL-4 and IL-17 in rats (n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model; ΔP < 0.05 vs SASP |
如Fig 2所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠MPO含量明显升高(P＜0.01)，EGF和TGF-β1含量明显降低(P＜0.01)。与模型组比较，SASP组及康复新液中、高剂量组大鼠结肠MPO含量明显降低(P＜0.01)，EGF和TGF-β1含量不同程度升高(P＜0.05或P＜0.01)。
|
| Fig 2 MPO, EGF and TGF-β1 levels in colon mucosa of UC rats (n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model; ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01 vs SASP |
显微镜下观察结肠组织病理切片，正常对照组黏膜上皮完整，可见杯形细胞，隐窝形态正常，炎细胞浸润不明显；其余各造模组大鼠结肠黏膜上皮可见不同程度的破损、杯状细胞和隐窝大量丢失，黏膜层和黏膜肌层炎性细胞大量浸润，并伴有明显水肿(Fig 3)。模型组HS评分明显高于正常组(P＜0.01)，SASP组和康复新液各剂量组HS评分均较模型组不同程度降低(P＜0.05或P＜0.01)，且康复新液高剂量组与SASP组效果相当。
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| Fig 3 Representative HE-stained colon sections(×100) A: Normal; B: Model; C: SASP; D: KFX-low; E: KFX-medium; F: KFX-high |
溃疡性结肠炎病因和发病机制尚不明确，可能由遗传、环境、免疫等多因素相互作用导致。CD4+ T细胞根据其功能分为Th1和Th2亚群，Th1细胞促进机体免疫反应，促进炎症发生，Th2则降低机体的免疫反应，T细胞的分化由Th1/Th2细胞因子诱导，Th1与Th2细胞平衡状态的破坏会导致免疫功能紊乱[9]。TNBS诱导SD大鼠的UC模型具有重复性好、造模时间短、炎症维持时间长等特点，并以引起Th1介导的反应为主，其组织学改变的许多特点与人类相似，被广泛用于结肠炎的药物研究[10]。
IL-4为Th2细胞因子，可诱导T细胞向Th2型分化，是抑制炎症反应和维持肠道免疫平衡的抗炎因子[11]。TGF-β1是一种具有较强抗炎作用的多效细胞因子，其主要作用是抑制炎症反应、调节细胞生长、增强免疫等[12]。本实验中，模型组血清IL-4含量、结肠组织TGF-β1明显低于正常组，提示TNBS诱导Th1型UC可能是因为该模型中Th2细胞因子IL-4的减少，导致Th1/Th2失衡。而康复新液可以使IL-4、TGF-β1水平升高，提示康复新液可调节抑炎因子的表达，使机体免疫功能重新恢复平衡状态。
IL-17由Th17细胞分泌，具有较强激活嗜中性粒细胞能力，诱导炎症的发生和组织损伤[13]。MPO由中性粒细胞分泌，其活性是中性粒细胞浸润的重要指标，也能间接反映肠道炎症活动程度，并可促进炎症部位细胞损伤[14]。本实验模型组中IL-17、MPO的表达明显升高，肠黏膜有大量炎性细胞浸润。而康复新液给药能明显下调IL-17、MPO含量，改善黏膜病理结构，提示康复新液可抑制中性粒细胞浸润、抑制炎症因子释放，从而限制炎症的发生和发展。
EGF具有诱导细胞分化、刺激组织生长修复、维持上皮细胞新陈代谢等重要功能[15]。实验结果发现，模型组EGF含量低于正常组，药物组均较模型组明显升高，提示康复新液可促进病变部位修复。
综上所述，康复新液对大鼠UC炎症有缓解作用，通过调节促炎因子与抑炎因子使到达平衡，抑制机体炎症，改善结肠组织病理变化，促进肠黏膜修复。
( 致谢: 大理大学昆虫生物医药研究院部分硕士研究生、教师及大理州第一人民医院病理科戴莉萍老师、陈莹老师曾参与承担本课题工作，谨此致谢。)
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