糖尿病是继肿瘤、心血管疾病后医学界的三大疑难病之一，严重危害人类的生命安全与健康。有报道指出，在世界范围内，大约有3.4亿人患有糖尿病[1]，而我国是糖尿病第一大国。肝脏是糖代谢的主要场所，有报道称糖尿病可增加肝硬化[2]、肝损伤[3]、肝癌[4]等一系列肝脏疾病的发生。肝纤维化是机体对慢性损伤的修复反应，是多种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段。有研究表明，高血糖能加剧肝脏相关疾病的进展。在慢性丙型肝炎患者中，高血糖是纤维化进展的一项独立的协同因素，伴随着更高的促纤维化效应[5]。在酒精诱导的肝脏疾病中，高血糖也作为一项很重要的促纤维化因子[6]。深入研究糖尿病相关肝纤维化的发病特点和发病机制，将有助于对糖尿病促发的肝纤维化的预防与治疗，具有重要临床意义。但目前能较好模拟人体高血糖并发/高发肝纤维化相关的实验动物模型尚缺，严重阻碍了机制等相关研究进展。为进一步探讨糖尿病对肝纤维化发生发展的影响，实验采用高脂喂养结合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导糖尿病大鼠模型[7]，四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导肝纤维化大鼠模型，观察糖尿病对CCl4诱导的大鼠化学性肝损伤/肝纤维化的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与饲料♂ Spague-Dawlay(SD)大鼠，SPF级，体质量(100~140) g，购自安徽医科大学实验动物中心。基础饲料及高脂饲料，由安徽医科大学实验动物中心提供，高脂饲料配方为：59%基础饲料、20%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇。蛋黄粉购自亳州市红日实业有限责任公司。
1.1.2 试剂CCl4(灿头西陇化工厂有限公司)；安稳血糖试纸条(长沙三诺生物传感技术有限公司)；STZ(美国Sigma公司)；天冬氨酸转氨酶(aminotransferase, ALT)、丙氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TCH)测试盒(南京建成生物工程研究所)；细胞组织裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF(上海碧云天公司)；抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)、β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。
1.1.3 仪器安稳型血糖仪(长沙三诺生物传感技术有限公司)；Western blot设备(美国Bio-Rad公司)；ABI9700型PCR仪(美国ABI公司)；3-16K高速离心机(美国Sigma公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；FA2004型电子天平(上海精天天平厂)。
1.2 方法 1.2.1 药物的配制柠檬酸缓冲液(pH 4.2~4.4)：称取一定量柠檬酸和柠檬酸三钠，分别配制100 mL的0.1 mol·L-1的溶液；取柠檬酸溶液50 mL，加入柠檬酸三钠溶液(约60 mL)，测定pH，混合均匀后4℃保存备用。STZ溶液的配制：避光称取一定量的STZ，加入柠檬酸缓冲液(pH 4.2~4.4)，配制成1%的STZ柠檬酸盐缓冲液。CCl4油溶液的制备，四氯化碳:橄榄油溶液=2:3。
1.2.2 动物分组与模型建立实验动物随机分为糖尿病组(n=45)、肝纤维化组(n=15)、对照组(n=15)。适应性饲养1周后，糖尿病大鼠用高脂饲料喂养6周，对照组和肝纤维化组用基础饲料喂养。6周后，糖尿病大鼠隔夜禁食12 h，腹腔注射0.1 mmol·L-1的STZ(45 mg·kg-1)柠檬酸盐缓冲液，肝纤维化组和对照组注射等体积柠檬酸盐缓冲液。72 h后尾尖采血测定空腹血糖，若空腹血糖≥7 mmol·L-1入糖尿病组[8]。继续喂养4周监测血糖，待血糖稳定后(模型确定成功)，随机抽取糖尿病大鼠20只和肝纤维化组大鼠皮下注射40% CCl4植物油溶液，首剂4 mL·kg-1，以后2 mL·kg-1，2次/周，共8周。对照组皮下注射等体积植物油溶液，在最后一次注射CCl4植物油溶液72 h后，隔夜禁食处死。实验期间糖尿病大鼠维持高脂饲料喂养，对照组和肝纤维化组用基础饲料喂养。每2周定期称量大鼠体重及尾尖采血测定大鼠血糖，记录大鼠体重及血糖变化。
1.2.3 葡萄糖耐量实验(OGTT)注射STZ 72 h后，对糖尿病大鼠进行OGTT检测(实验前禁食8 h)，灌胃给予大鼠葡萄糖(2 g·kg-1)，在0、0.5、1、2 h分别采尾静脉血，测定血糖水平。
1.2.4 HE染色在大鼠肝脏右叶相同位置取组织，用10%甲醛溶液固定48 h后，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察染色结果并拍照，分析和评价大鼠肝损伤和纤维化程度。
1.2.5 血清学指标检测大鼠麻醉后剖腹，腹主动脉取血，4℃、3 500×g，离心15 min，取上层血清按测试盒说明书测定TG、TCH、AST、ALT。
1.2.6 Western blot检测蛋白表达取大鼠肝组织50 mg于匀浆器中剪碎，加入1 mL RIPA蛋白裂解液(含PMSF)，冰上充分研磨至均匀混悬液后，转移至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r·min-1离心30 min，收集上清。用定量仪对蛋白样品定量，调整浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃煮10 min使蛋白变性。每孔加15 μL总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，膜用5%脱脂奶粉(TBST配制)在室温下封闭3 h，用TBST清洗后，一抗4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜用TBST清洗后，与相应二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内参，Image J软件分析条带的灰度值。
1.2.7 q-PCR检测基因表达取大鼠肝组织30 mg于匀浆器中剪碎，加入1 mL TRIzol裂解液，冰上充分研磨至均匀混悬液后，转移至1.5 mL的EP管中，加入0.2 mL的氯仿，颠倒混匀，4℃、12 000 r·min-1离心15 min；转上层水相至另一EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀后于-20℃助沉1 h；取出，4℃、12 000 r·min-1离心15 min，弃上清，加入预冷的75%乙醇；4℃、7 500 r·min-1离心5 min后，弃去上清，干燥5 min，加入适量的无酶水；逆转录前，RNA用定量仪测定浓度，采用10 μL逆转录反应体系，根据逆转录试剂盒说明书操作。q-PCR反应，将cDNA用无酶水稀释10倍，上、下游引物各稀释10倍后，按10 μL体系将反应物加至q-PCR 96孔反应板中，每组至少3个复孔，冰上操作，引物序列见Tab 1。
| Gene | Forward | Reverse |
| α-SMA | 5′-CGAAGCGCAGAGCAAGAGA-3′ | 5′-CATGTCGTCCCAGTTGGTGAT-3′ |
| Collagen Ⅰ | 5′-GATCCTGCCGATGTCGCTAT-3′ | 5′-TGTAGGCTAGCTGTTCTTGCA-3′ |
| β-actin | 5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′ | 5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′ |
采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，用One-Way ANOVA检验各组间差异的显著性。
2 结果 2.1 大鼠的一般情况对照组大鼠精神状态良好、活动自如、皮毛正常无明显脱落；肝纤维化组大鼠精神状态一般，不喜运动，伴有毛发脱落；糖尿病组大鼠精神状态较差，行动迟缓，皮毛粗糙；糖尿病合并肝纤维化双模型组大鼠精神差，反应迟钝，皮毛凌乱无色泽，易脱落。高脂加STZ建立糖尿病模型成模率很高，45只大鼠共有42只成功，实验结束时，糖尿病及双模型组共有5只大鼠死亡，正常组和肝纤维化组无死亡，实验数据取每组10只进行统计学分析。
2.2 注射STZ后大鼠的血糖变化注射STZ 72 h后, 对大鼠进行OGTT检测。Tab 2 OGTT结果显示，糖尿病大鼠空腹血糖(0 h)和2 h血糖均升高。
| Group | Mean blood glucose levels/mmol·L-1 | |||
| 0 h | 0.5 h | 1 h | 2 h | |
| Control | 3.60±0.28 | 4.80±0.78 | 5.50±0.64 | 4.10±0.28 |
| STZ | 14.40±4.08** | 23.10±2.55** | 25.00±1.50** | 22.30±2.42** |
| **P < 0.01 vs control group | ||||
在初步确定糖尿病模型成功后，监测4周空腹血糖，观察模型的稳定性。Tab 3结果显示，与对照组相比，糖尿病组大鼠血糖明显升高。4~12周纤维化和双模型组CCl4造模，动态观察各组大鼠血糖，结果显示，与对照组各时间段相比，糖尿病组空腹血糖稳定升高(P < 0.01)，肝纤维化组无明显变化，糖尿病合并肝纤维化组空腹血糖明显升高(P < 0.01)；与单纯糖尿病组相比，糖尿病合并肝纤维化组空腹血糖无明显变化。
| Group | Time/week | |||||
| 0 | 2 | 4 | 6 | 10 | 12 | |
| Control | 3.82±0.37 | 4.02±0.59 | 3.80±0.45 | 3.80±0.14 | 3.65±0.44 | 3.93±0.30 |
| Diabetes | 11.86±3.25** | 14.81±4.04** | 14.24±4.68** | 16.28±4.76** | 17.70±5.17** | 17.78±7.25** |
| Liver fibrosis | 3.57±0.56 | 3.71±0.41 | 3.81±0.33 | 3.69±0.54 | 3.79±0.33 | 3.76±0.30 |
| Double models | 11.54±3.00**## | 13.45±5.20**## | 15.03±4.01**## | 15.65±4.98**## | 17.52±5.09**## | 16.47±6.09**## |
| **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs liver fibrosis group | ||||||
在适应性喂养1周，糖尿病组高脂喂养6周，其它组普通饲料喂养6周后，各组大鼠体重增加明显，但各组之间无差异。随后，每2周定期测定大鼠体重，Tab 4结果显示，正常组大鼠体重逐渐升高，糖尿病组与双模型组大鼠体重降低，肝纤维组在未造模前，体重逐渐升高，造模后缓慢降低；与对照组各时间段相比，糖尿病大鼠从STZ注射后4周开始，大鼠体重明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，肝纤维化组0~12周体重均无明显变化，糖尿病合并肝纤维化组大鼠体重明显降低(P < 0.01)；与糖尿病组各时间段相比，糖尿病合并肝纤维化组体重无明显变化；与肝纤维化组各时间段相比，糖尿病合并肝纤维化组体重明显降低(P < 0.01)。
| Group | Time/week | ||||||
| 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | |
| Control | 274.80±10.18 | 348.80±35.37 | 355.30±38.93 | 359.50±36.88 | 382.00±47.44 | 382.30±43.06 | 405.80±41.80 |
| Diabetes | 292.00±51.19 | 286.60±47.75 | 286.80±42.42* | 274.40±46.33* | 266.80±49.70** | 262.20±46.53** | 257.80±51.25** |
| Liver fibrosis | 266.67±27.15 | 305.93±50.47 | 336.64±39.63 | 361.85±42.76 | 357.71±49.81 | 357.69±44.94 | 328.77±57.97* |
| Double models | 308.94±36.50 | 294.07±25.16**## | 288.20±31.60**## | 271.00±28.91**## | 253.50±28.05**## | 248.60±36.21**## | 232.43±35.32**## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs liver fibrosis group | |||||||
如Fig 1 HE染色所示，对照组大鼠肝细胞排列整齐，肝组织结构完整；糖尿病组肝脏结构轻度破坏，有炎性坏死、脂肪变性；肝纤维化组肝组织结构破坏较严重，细胞出现广泛脂肪变性、炎性坏死，以汇管区及中央静脉周围较重，且有胶原纤维沉积；糖尿病合并肝纤维化双模型组肝组织结构破坏严重，肝细胞严重脂肪变性、炎性坏死，纤维结缔组织增生形成纤维条索，伸入肝实质内。
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| Fig 1 HE staining of rat liver tissues (×200) A: Control group; B: Diabetes group; C: Liver fibrosis group; D: Double models group. |
如Fig 2所示，与对照组相比，糖尿病组大鼠TCH及TG值升高(P < 0.01)，肝纤维化组无明显差异；与糖尿病和肝纤维化组相比，双模型组大鼠TCH及TG值均明显升高，差异具有显著性(P < 0.01)。
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| Fig 2 TG and TCH levels of each group **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs diabetes group; △△P < 0.01 vs liver fibrosis group |
如Fig 3所示，与对照组相比，糖尿病大鼠和肝纤维化组大鼠AST和ALT值均升高(P < 0.01)；与糖尿病组和肝纤维化组相比，双模型组大鼠AST和ALT值升高，差异均有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01)。
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| Fig 3 The AST and ALT levels of each groups **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs diabetes group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs liver fibrosis group |
如Fig 4所示，与对照组相比，3组大鼠α-SMA和Collagen Ⅰ的蛋白表达均增加(P < 0.05, P < 0.01)，糖尿病合并肝纤维化双模型组与单纯糖尿病和肝纤维化组相比，差异均有统计学意义(P < 0.01)。
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| Fig 4 Expression of α-SMA and collagen Ⅰ protein in liver tissues of each group *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs diabetes group; △△P < 0.01 vs liver fibrosis group |
如Fig 5所示，与对照组相比，3组大鼠α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA表达均增加(P < 0.01)，增加最明显的是糖尿病合并肝纤维化双模型组，与单纯糖尿病和肝纤维化组相比，差异有统计学意义(P < 0.01)。
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| Fig 5 Expression of α-SMA and collagen Ⅰ mRNA in liver tissues of each group **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs diabetes group; △△P < 0.01 vs liver fibrosis group |
肝纤维化是肝脏对自身多次创伤修复的结果，可由多种因子引起的慢性疾病，其本质是以α-SMA、Collagen Ⅰ等为主要成分的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积[9]。糖尿病是一类慢性的、具有破坏性和与年龄相关的代谢性疾病[10]，其对肝脏的正常功能有着一定的影响，可增加一系列肝脏疾病的发生，如肝癌、肝硬化等[2-4]。研究表明，高血糖对肾脏、神经、血管的纤维化形成均有明显的促进作用[8]。近期有报道指出，体外高糖培养可以刺激肝星状细胞的增殖和胶原的生成[8, 11]，诱导肝星状细胞炎症因子释放[12]。
STZ是一种广谱抗生素，其对动物的胰岛β细胞有着高度选择性毒性作用，因此可作为糖尿病模型的工具药使用来诱导糖尿病[13-15]。本实验采用高脂喂养后腹腔注射STZ的方法，制备类似于人体的2型糖尿病大鼠模型。OGTT检测确定糖尿病模型成功。定期检测血糖和体重。结果显示，大鼠在注射STZ造模后，空腹血糖稳定升高，体重明显降低，表明模型稳定，造模成功。临床上糖尿病患者多伴有血清学指标TG和TCH的升高，本实验结果显示，与对照组相比，糖尿病组大鼠TG和TCH值均升高，亦提示糖尿病大鼠模型构建成功。HE结果显示，糖尿病组大鼠肝组织出现一定的损伤并有炎症和脂肪变性，提示糖尿病与肝脏疾病的发生有着密切联系，而糖尿病合并肝纤维化模型大鼠与单纯肝纤维化组相比，大鼠肝组织损坏更严重，肝纤维化程度明显加深，提示糖尿病本身可加重CCl4化学性肝损伤致肝纤维化的进程。
AST和ALT是常用检测肝功能的血清转氨酶指标，血液中AST和ALT水平升高，提示肝脏受损或损坏。本实验中AST和ALT检测结果显示，与对照组相比，糖尿病大鼠和肝纤维化组大鼠AST和ALT值均升高，与糖尿病组和肝纤维化组相比，双模型组大鼠AST和ALT值升高更明显，差异有统计学意义，提示糖尿病组和肝纤维化组大鼠均有不同程度的肝损伤，且糖尿病本身可加重CCl4诱导的肝损伤程度。α-SMA和Collagen Ⅰ是肝纤维化中ECM的主要成分，肝组织中ECM的生成和降解直接影响肝纤维化的生成。各组大鼠α-SMA和Collagen Ⅰ的表达结果显示，与对照组相比，糖尿病组大鼠α-SMA、Collagen Ⅰ mRNA及蛋白表达均增加，且有统计学差异，糖尿病合并肝纤维化双模型组升高的更明显，与单纯糖尿病和肝纤维化组相比有统计学差异。提示糖尿病高糖高脂状态可能通过影响ECM的生成和(或)降解，参与肝纤维化的发生、发展，但具体机制如何，有待于进一步的实验验证。
综上所述，糖尿病本身可诱发肝损伤，尚可加剧CCl4诱导的肝纤维化的病变，其机制可能与影响ECM的生成和(或)降解有关，为临床上防治糖尿病相关性肝纤维化提供了新的思路。
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