2. 重庆医科大学 药理学院，重庆 400016
2. Dept of Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
全脑缺血引发海马CA1区锥体神经元的大量死亡，常导致认知和记忆功能缺损。成年哺乳动物海马齿状回(dentate gyrus，DG)中的神经干细胞(neural stem cell, NSC)可以产生新生的神经元，并整合到神经网络中，从而改善全脑缺血后小鼠的认知功能[1]。然而，内源性神经发生的NSC数量远远不足，且其存活率也不高，就需要扩大内源性的神经发生。肝X受体(liver X receptor, LXR)是核受体家族成员中重要的一员，有α和β两种亚型。LXRα主要在脂类代谢有关的器官高表达，LXRβ几乎在所有的组织和器官内表达，尤其在脑。研究表明，TO901317能够非选择性地激活LXRα和LXRβ，其激活后能够使LXR的目标基因ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)表达增加。激活后的LXR具有调节脂质代谢、抑制炎症、促进神经保护、促进神经发生的作用[2-3]。神经发生包括NSC的增殖、迁移、分化、存活等诸多复杂的环节，并受到一些分子机制的调控。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)能够促进细胞的增殖、分化、存活等，在神经系统发生、发育过程中有重要的作用，同时在神经系统损伤的情况下具有神经保护与修复的作用[4]，且BDNF能够促进内源性NSC的神经发生[5]。而BDNF基因转录的启动是由于细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)的磷酸化，从而激活环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein, CREB)而发生。因此，本课题探讨LXR激活对全脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)小鼠海马齿状回NSC的增殖与认知功能的影响，其机制是否与激活ERK1/2-CREB-BDNF信号通路有关，从而促进I/R小鼠海马DG区内源性神经发生。
1 材料 1.1 试剂TO901317(纯度99%)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU，纯度99%)均购自Sigma公司；兔抗BrdU单克隆抗体、兔抗双皮质素(doublecortin，DCX)单克隆抗体、兔抗p-CREB多克隆抗体、兔抗LXRα多克隆抗体、兔抗LXRβ多克隆抗体，均购自美国Abcam公司；兔抗p-ERK1/2、t-ERK1/2、t-CREB多克隆抗体(万类生物公司)；兔抗BDNF多克隆抗体(武汉三鹰公司); 兔抗ABCA1多克隆抗体(美国Immunoway公司)；鼠抗β-actin多克隆抗体(北京博奥森公司)。
1.2 仪器Morris水迷宫系统(淮北正华生物仪器设备有限公司)；凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；全自动酶标仪(Spectra Max M2，美国)；光学显微镜(Nikon，日本)；激光共聚焦显微镜(Nikon A1+R，日本)。
2 方法 2.1 实验动物与分组成年♂ C57BL/6小鼠(SPF级)，购自重庆医科大学实验动物中心。75只♂ C57小鼠，体质量(24±2) g，随机分为假手术组(Sham组)、全脑缺血/再灌注组(I/R组)、全脑缺血/再灌注+TO901317组(I/R+TO90组)，每组25只。其中Morris水迷宫实验各组6只，HE染色各组5只，免疫组化各组5只，免疫荧光各组5只，Western blot检测各组4只。
2.2 小鼠双侧颈总动脉夹闭(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)模型的制备[6]3.5%水合氯醛进行腹腔注射麻醉后，分离左、右颈总动脉，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉20 min，然后取下动脉夹，进行缝合。Sham组不用动脉夹夹闭，只需要对其进行分离。
2.3 实验动物的给药将TO901317溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，I/R+TO90组造模后24 h采用TO901317腹腔注射，剂量30 mg·kg-1，每天1次，连续14 d。Sham组和I/R组在相同时候给予同体积的DMSO腹腔注射。造模后9~12 d各组小鼠腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1)，每天1次，持续4 d。
2.4 行为学测试[1]各组选择6只小鼠在再灌注后d 28进行Morris水迷宫实验。小鼠在水迷宫的4个象限中游泳，Morris水迷宫直径120 cm、高45 cm，里面有直径10 cm的平台1个，位于水面下1 cm。各象限为小鼠进行Morris水迷宫实验时的入水点，用电脑记录实验数据。训练d 1让小鼠在平台上适应60 s，然后将小鼠放入水中，让其游至平台，60 s内没有找到隐藏平台者，由实验者将该小鼠引导至隐藏平台停留30 s，然后终止该小鼠实验。d 2~5小鼠分别由4个象限沿水池壁入水训练，记录其找到隐藏平台的时间，如果超过60 s则按照60 s计算。d 6移去隐藏在水下的平台，将小鼠放入水中，记录60 s内各小鼠在原平台所在象限内的跨台次数。
2.5 HE染色观察组织病理学形态再灌注后7 d，各组选择5只小鼠进行HE染色，染色后，在显微镜下观察各组小鼠海马CA1区神经元的形态结构变化，在400倍显微镜下随机取非重叠视野5个，并对CA1区正常神经元进行计数，计算出每只小鼠海马CA1区400倍视野下正常神经元的个数。
2.6 免疫组织化学检测DCX阳性细胞数目各组选择5只小鼠。用免疫组化方法检测海马DG区DCX阳性细胞的表达(DCX标记新生的神经元)，按试剂盒说明书逐项操作。DCX阳性细胞呈棕黄色，切片的选择及细胞计数的方法同HE染色，计算每只小鼠海马DG区每个高倍镜视野下的平均DCX阳性细胞数。
2.7 BrdU免疫荧光各组选5只小鼠。I/R后14 d，水合氯醛麻醉小鼠后心脏灌注，脑组织用蔗糖溶液进行梯度脱水，后冠状切片厚10 μm。50%甲酰胺65℃修复后加盐酸、硼酸等处理30 min。山羊血清封闭，加BrdU一抗(1：200，PBS阴性对照)，4℃过夜。加二抗37℃ 1 h，DAPI染色5 min，甘油封片。观察海马DG区BrdU阳性细胞。应用Image-pro plus6.0进行图像分析。
2.8 Western blot检测各组选择4只小鼠。I/R后14 d，3.5%水合氯醛麻醉小鼠后断头取脑，在冰上迅速用弯镊分离出小鼠的双侧海马，立刻放在液氮里。经过电泳、电转、封闭等步骤后，加一抗p-ERK1/2(1：300)、t-ERK1/2(1：500)、p-CREB(1：800)、t-CREB(1：1 000)、BDNF(1：1 000)、LXRα(1：300)、LXRβ(1：500)、ABCA1(1：1 000)、β-actin(1：1 000)，4℃孵育过夜。加二抗(1：3 000)，显影。用Fusion软件分析。
2.9 统计学方法使用SPSS 21.0进行数据处理，数据用x±s表示，多组间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较用LSD检验。
3 结果 3.1 LXR激活对全脑I/R小鼠空间学习记忆能力的影响在d 1~5的定位航行实验中，各组小鼠找到水下平台的时间随着天数的增加均逐渐减少。与Sham组比较，I/R组小鼠找到隐藏平台的时间明显延长(P＜0.05，P＜0.01)；与I/R组比较，I/R+TO90组小鼠找到隐藏平台的时间明显缩短(P＜0.01)。在空间探索实验中，Sham组和I/R+TO90组小鼠穿越原平台所在象限的次数均明显高于I/R组(P＜0.01)。表明在全脑缺血后，激活LXR能够改善小鼠受损的学习记忆等认知功能，见Tab 1、Fig 1。
| Group | Escape latency/s | Number of crossings | ||||
| d 1 | d 2 | d 3 | d 4 | d 5 | ||
| Sham | 44.81±10.55 | 25.48±4.06 | 17.64±4.37 | 13.82±2.24 | 9.87±2.67 | 6.13±1.12 |
| I/R | 57.96±4.03* | 52.16±5.86** | 37.03±5.59** | 28.11±3.55** | 19.29±3.69** | 0.87±0.67** |
| I/R+TO90 | 50.83±7.06# | 32.52±3.97## | 21.14±4.64## | 18.44±3.67## | 12.54±3.26# | 3.45±0.82## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham; #P < 0.05，##P < 0.01 vs I/R | ||||||
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| Fig 1 Typical trajectories of place navigation test |
Fig 2 HE染色可见，Sham组小鼠海马CA1区锥体神经元结构清晰，排列紧密，核圆形，染色清晰，呈深蓝色；而I/R组和I/R+TO90组神经元结构不规则，出现明显核固缩，排列松散，神经细胞数目明显减少(P＜0.01)。说明所造模型成功可靠，并且稳定。
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| Fig 2 Pathology of hippocampal CA1 region in mice after I/R 7 days observed by HE staining (× 400) A: Microphotographs showed the histological changes of CA1 region in hippocampal; B: Histograms showed the numbers of CA1 neurons in hippocampal. **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs I/R group |
免疫组化检测小鼠海马DCX阳性细胞的表达，如Fig 3A、3B所示，Sham组和I/R组小鼠海马DG区可见少量的DCX阳性细胞；而I/R阳性TO90组小鼠DCX阳性细胞沿海马DG区分布，且较Sham组和I/R组的DCX阳性细胞明显增多(P＜0.01)。
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| Fig 3 Effect of LXR activation on BrdU+ and DCX+ cells in hippocampus of mice with global cerebral ischemia (x±s, n=5) A, B: Effect of LXR activation on hippocampal DCX+ cells in mice with global cerebral ischemia (immunohistochemistry, ×400); C, D: Effect of LXR activation on hippocampal BrdU+ cells in global cerebral ischemia mice (immunofluorescence, ×200). *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs I/R group |
免疫荧光检测小鼠海马BrdU阳性细胞的表达，如Fig 3C、3D所示，Sham组小鼠海马DG区仅见少量的BrdU阳性细胞; I/R组海马DG区较Sham组出现较多BrdU阳性细胞(P＜0.01)；给予I/R小鼠LXR激动剂TO901317处理后，海马DG区BrdU阳性细胞数明显增多(P＜0.01)。
3.5 LXR激活对LXRα、LXRβ、ABCA1蛋白表达的影响如Fig 4所示，3组小鼠海马内均有LXRα、LXRβ、ABCA1蛋白的表达，LXRα与LXRβ在3组间没有太大变化，而ABCA1在I/R+TO90组中的表达呈明显上升趋势(P＜0.05，P＜0.01)。说明非选择性LXR激动剂TO901317引起了LXRα和LXRβ在脑内的激活，使下游基因ABCA1的表达明显增加。
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| Fig 4 Expression of LXRα, LXRβ and ABCA1 protein in hippocampus of mice by Western blot (x±s, n=4) **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs I/R group |
如Fig 5所示，3组小鼠海马内均有t-ERK1/2和t-CREB蛋白的表达，但各组间无统计学意义。Sham组小鼠海马p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达较低，与Sham组相比，I/R组小鼠海马p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平增加(P＜0.05)。与I/R组相比，使用LXR激动剂TO901317干预后，I/R+TO90组p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达明显上升(P＜0.01)。Sham组小鼠表达少量BDNF蛋白；与Sham组相比，I/R组小鼠海马BDNF蛋白表达水平增加(P＜0.01)，而I/R+TO90组BDNF蛋白的表达水平较I/R组又进一步增加(P＜0.01)。
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| Fig 5 Expression of p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-CREB, t-CREB, BDNF protein in hippocampus of mice by Western blot (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs sham group; ##P < 0.01 vs I/R group |
全脑I/R模型模拟的是临床上心脏骤停、休克、窒息等疾病发生、发展的病理生理过程。小鼠在经受I/R后，受损的主要是对缺血比较敏感的海马，I/R使海马CA1区锥体神经元大量死亡及海马的功能受损，从而损害了学习记忆能力[7]。神经发生是指NSC在一定条件下增殖、分化、迁移，并且参与神经功能恢复的过程。大量研究证实，成年哺乳动物的神经发生存在于海马DG和侧脑室室管膜下区(subventricularzone，SVZ)两个区域，从而使认知功能在一定程度上得到改善[8-9]。全脑缺血、睡眠剥夺、运动等能诱导体内NSC增殖分化为神经元，从而整合到已有的神经网络中发挥其生理功能[10-11]。
我们前期研究发现，全脑缺血后即刻腹腔注射LXR激动剂可减少炎症因子的表达，发挥脑保护作用。另有研究发现，LXR配体在斑马鱼体内可以促进神经发育。值得注意的是，每个配体选择性地调节不同的中脑神经元种群的发育[3]。同时，用氧甾醇激活LXR配体，增加了小鼠胚胎干细胞多巴胺(dopamine, DA)神经元的数量，LXR敲除后，胚胎鼠DA神经元的数量明显减少，说明LXR可促进胚胎鼠中脑神经再生[12]。但LXR激活能否促进全脑缺血小鼠DG区NSC增殖，从而改善认知功能，目前未见报道。
本研究结果表明，在缺血24 h，LXR激活能够促进全脑缺血小鼠海马NSC的增殖，能够使全脑缺血导致的小鼠学习、记忆等认知功能缺损得到改善，上调全脑缺血小鼠海马p-ERK1/2、p-CREB、BDNF等蛋白的表达。
成年海马的神经发生受到一系列机制的调控，其中ERK1/2对细胞的增殖分化有重要作用。ERK1/2磷酸化后的p-ERK对下游转录因子CREB进行调控，而CREB在活化后形成p-CREB，p-CREB能够特异性结合下游的BDNF编码基因的启动子，从而促进BDNF的转录[13-14]。BDNF是一类对神经细胞的增殖、营养、分化等具有重要作用的蛋白质。这种营养因子能协调生物功能，除了它的醛脱氢酶可塑性过程外，还可以通过异源传递的长期作用，促进神经元前体细胞的蛋白质分化、突触形成和神经元生存[15]。本实验结果显示，LXR激活可能通过激活ERK1/2-CREB-BDNF信号通路，上调全脑I/R后小鼠海马BDNF蛋白的表达，促进小鼠海马NSC的增殖。
综上，LXR激活可能通过激活ERK1/2-CREB-BDNF信号通路，使BDNF表达升高，进而促进小鼠齿状回区海马NSC的增殖，使全脑I/R后小鼠的认知功能障碍得到改善。
( 致谢: 本实验在重庆医科大学附属第一医院实验研究中心完成，感谢实验研究中心各位老师的指导和帮助。)
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